自体骨髓干细胞移植治疗下肢缺血性疾病的疗效观察

任 超，刘小云，耿德勤，葛 巍，张伟伟，李金梅，万美容，徐 铁

下肢动脉缺血性疾病包括下肢动脉硬化闭塞症、下肢血栓闭塞性脉管炎和糖尿病性下肢动脉硬化闭塞症 (糖尿病足)等，这些疾病的共同特点是因动脉管腔狭窄或闭塞导致远端组织缺氧、组织变性或坏死等病理改变，临床表现为肢体冰凉、麻木、间歇性跛行、静息痛，皮肤溃疡或坏疽等［1-2］。随着人们生活水平的提高，饮食结构和生活方式的改变以及社会人口老龄化的到来，下肢动脉缺血性疾病的发病率与日俱增，如年龄＞50岁的糖尿病患者发生下肢动脉硬化闭塞症较非糖尿病患者高40倍，虽其在内科、外科、介入等治疗方面取得了较大的进展，但仍没有彻底治愈的方法，近年来自体骨髓干细胞移植是一个有效手段［3-6］。我们一直致力于骨髓干细胞在神经系统疾病的基础和临床研究［7-10］，部分成果已经申请相关专利 (专利号:ZL0810020094.3)，在充分的理论基础和先进的技术水平条件下，开展了自体骨髓干细胞移植治疗下肢缺血性疾病的临床应用初探，目前已治疗患者10多例，其中随访满2年，且资料全的有2例。在此分享这2例患者的研究成果，为广大医务工作者提供一些参考，从而推动自体骨髓干细胞移植治疗下肢缺血性疾病在临床应用。

1 资料与方法

1.1 纳入与排除标准 纳入标准:(1)经支持治疗，生命体征平稳者。(2)入选前均经过医院伦理委员会批准，患者签署特殊治疗同意书。(3)使用自体骨髓源干细胞治疗者。 (4)能配合随访者。排除标准:非自体骨髓源干细胞治疗、不能配合随访及资料不全者。

1.2 病例简介 患者1，男，69岁，因“多饮、多尿伴消瘦13年，左足溃烂1个月”2010-02-10入院，既往有2型糖尿病病史，入院后查空腹血糖18.4 mmol/L，双下肢动脉彩超示双足背动脉粥样硬化闭塞症且双下肢股总、股深、股浅、腘动脉粥样硬化，电子计算机断层扫描血管造影 (CTA)显示左足部供血血管稀疏，诊断为2型糖尿病致左下肢糖尿病足 (坏疽型)。

患者2，男，64岁，因“左下肢间歇性跛行1个月”2010-06-01入院，入院后双下肢CTA示左侧股动脉远端、左腘动脉、左胫前动脉、左胫后动脉节段性管腔闭塞且左小腿动脉显影浅淡，诊断为下肢动脉粥样硬化并血栓形成致左下肢动脉闭塞症。

1.3 实施方案

1.3.1 操作流程图见图1。

图1 操作流程图Figure 1 Operation flow chart

1.3.2 具体操作

1.3.2.1 骨髓干细胞的获取过程 患者取俯卧位，局麻后双侧髂后上棘穿刺。用带侧孔针，多方向、多层次抽取骨髓血，每侧取100 ml左右，一般共取200～300 ml。肝素钠盐水抗凝 (浓度 1 mg∶10 ml)，每支20 ml注射器预先抽吸肝素钠盐水2 ml，抽取骨髓后不断摇均，切忌凝血。抽完后立即送实验室，密度梯度离心法分离获得单个核细胞，然后培养、鉴定、纯化、扩增、无菌化处理、收集获得骨髓干细胞，留一半冻存备用，剩下一半用0.9%氯化钠溶液制备成单个核细胞混悬液约50 ml。

此过程团队组成为床位医师、床位护士、实验员，分工为:床位医师负责骨穿取髓的具体操作;实验员负责分离、培养、鉴定、纯化、扩增、无菌化处理、收集获得骨髓干细胞;这期间护士工作相对较重要［11］:(1)心理护理:2位患者均年老体弱合并症较多，多次求医效果不佳，造成患者严重的心理负担而产生紧张、焦虑、悲观、失望、恐惧等心理问题。术前做好患者心理护理及访视工作，耐心介绍干细胞采集及移植手术相关护理问题，介绍手术室环境、过程及对患者进行全面评估而制定相应护理计划及措施，帮助患者度过术前心理准备期。(2)生活指导:重点告知休息和活动时患肢的体位摆放，并指导患者进食一些清淡易消化的高蛋白、高维生素饮食。(3)自体骨髓干细胞采集期护理:在此期间注意观察患者有无心肌缺血而导致心律不齐、心绞痛、心肌梗死;脑缺血导致头痛、眩晕、恶心呕吐、视物不清、晕厥以及抗凝药物过敏等不良反应及生命体征变化以便及时抢救。采集干细胞过程中还要注意观察患者双腿有无冰凉、抽搐等症状，可用热水袋热敷或遵医嘱口服葡萄糖酸钙等措施。采集骨髓完毕穿刺部位加压包扎，并观察穿刺点有无异常变化。

1.3.2.2 干细胞的移植 在连续硬膜外麻醉下进行下肢腓肠肌内注射骨髓干细胞。在闭塞平面近端开始，沿大血管走行方向按1.5 cm×1.5 cm点位注射，一定要注在肌肉内，直至肢体远端，在溃疡周围则以更密集的方式注射。

患者1共移植3次。取骨髓时间为2010-02-12，首次进行干细胞移植时间为2010-02-17(干细胞数4.90×1010/ml)，第2次时间为2010-02-20(干细胞数5.21×1010/ml)，第3次时间为2010-02-23(干细胞数5.50×1010/ml)。

患者2共移植3次。取骨髓时间为2010-06-03，首次进行干细胞移植时间为2010-06-10(干细胞数3.89×1010/ml)，第2次时间为2010-06-15(干细胞数4.57×1010/ml)，第3次时间为2010-06-20(干细胞数5.21×1010/ml)。

此过程团队组成为手术医师、麻醉医师、手术护士，分工为:手术医师负责骨髓干细胞的肌肉注射;麻醉医师负责麻醉及监护;手术护士期间工作亦相对重要［12］:(1)心理护理:基本同上。(2)术中护理:注意患者体位舒适、保暖，协助医生。(3)术后护理:观察生命体征，监测患肢末梢循环皮肤温度、颜色、动脉搏动等情况;保持双下肢肌肉注射部位敷料清洁、干燥，换药1次/d，观察局部有无出血、感染，观察穿刺局部是否有渗血、瘀斑及血肿并记录，如有异常及时处理。同时还要加强患者家属健康宣教，指导家属及患者移植后如何适度活动、如何高蛋白高维生素清淡饮食、如何保证充足睡眠，做到身心全面护理。

1.3.2.3 术后监测 术后均进行1周的生命体征监测，详细记录患者是否移植后出现不适。此工作主要是床位护士在床位医师的指导下进行，基本同术后护理。

1.3.2.4 随访及治疗效果判定 术后随访均由受过系统培训的专业医师对患者治疗效果进行评定。主要指标是:实验室检查指标，如皮温、侧支循环;临床症状指标，如疼痛、冷感、麻木、溃疡、跛行等［13］。

2 结果

患者1干细胞移植治疗前，左足第四足趾坏死、溃烂，趾根和脚面连接处可见脓性分泌物，疼痛，不能行走;查体可见足背动脉搏动基本消失、皮温下降;双下肢动脉彩超示双足背动脉粥样硬化闭塞症且双下肢股总、股深、股浅、腘动脉粥样硬化，CTA显示左足部供血血管稀疏。经干细胞移植后，对患者病情进行随访，治疗后1个月足部疼痛减轻。治疗后3个月皮温较前升高，可感觉到微弱足背动脉搏动。治疗后6个月溃疡面开始出现愈合，皮温亦继续升高，色泽转红润。治疗后1年溃疡愈合面积继续增大。治疗后2年CTA示供血血管较前有再通，仅有一小块溃疡未愈合 (见图2、3)。患者3次移植，未见注射局部及全身有明显不良反应发生。2年随访中未见肿瘤形成等干细胞移植可能并发症。

患者2干细胞移植治疗前，左下肢酸痛、无力，呈间歇性跛行发作，直立或行走后疼痛加剧，休息可得到部分缓解。查体见左足第四、五足趾发绀、粗糙，足背动脉搏动微弱、皮温下降;双下肢CTA示左侧股动脉远端、左腘动脉、左胫前动脉、左胫后动脉节段性官腔闭塞且左小腿动脉显影浅淡。经干细胞移植后，对患者病情进行随访，治疗后1个月站立时疼痛减轻，足背动脉搏动增强，皮温较前升高。治疗后3个月行走距离增长，疼痛次数减少。治疗后6个月左足第四、五足趾色泽转红润。治疗后1年左足第四、五足趾光滑不再粗糙。治疗后2年CTA示供血血管较前丰富 (见图4、5)。患者3次移植，未见注射局部及全身有明显不良反应发生。2年随访中未见肿瘤形成等干细胞移植可能并发症。

3 讨论

下肢动脉缺血性疾病已成为危害当今健康的严重疾患，尽管血管搭桥和血管腔内介入治疗对有些患者能取得较好的近期疗效，但远期效果常不理想，患者常有面临截肢 (趾)的危险。依据干细胞具有多种分化潜能，并能够提供各种成血管细胞因素的原理，治疗性血管生成［13-15］的新理念被提出，即将患者自体的干细胞分离出来，种植到缺血部位，生成新的毛细血管网。Asahara等［16］发现纯化CD34+造血干细胞能在体外分化为有内皮细胞表型的细胞，并将其称为血管内皮祖细胞(EPCs)，开创了治疗性血管新生的时代［17-19］。

图2 患者1治疗前后患肢大体变化Figure 2 General changes in lesions limb of patient 1 before and after treatment

图3 患者1治疗前后血管造影变化Figure 3 CTA changes in lesions limb of patient 1 before and after treatment

图4 患者2治疗前后患肢大体变化Figure 4 General changes in lesions limb of patient 2 before and after treatment

图5 患者2治疗前后血管造影变化Figure 5 CTA changes in lesions limb of patient 2 before and after treatment

成体干细胞具有多分化潜能，可分化为血管内皮细胞，进一步分化形成新生毛细血管，自体干细胞移植正是利用这一原理，将干细胞移植到缺血的肢体肌肉中，使其分化、形成新生毛细血管，改善和恢复下肢血流，达到治疗下肢缺血的目的。为骨髓干细胞移植治疗下肢缺血提供了基础。Tateishi-Yuyama等［20］于 2002 年在国际上首次报道应用患者自体骨髓干细胞移植治疗缺血性下肢血管病，取得了满意疗效。北京宣武医院谷涌泉［21］于2008年在我国率先应用自体骨髓干细胞移植治疗慢性下肢缺血性疾病这一国际先进技术。自该技术开展以来，其疗效已得到肯定。本研究利用骨髓干细胞自体移植治疗下肢缺血性疾病，获得了良好疗效，其结果和谷涌泉等［6，21-22］的报道类似，自体骨髓干细胞移植对肢体疼痛、冷感、麻木、溃疡等有疗效，且未发现明显不良反应。

对于症状轻、血管和身体条件好者，应以传统非手术治疗和手术治疗为主。而自体骨髓干细胞移植主要适用于症状较重(合并静息痛、溃疡、坏疽者)者保守治疗无好转、远端流出道狭窄、不适合外科搭桥术者;高龄、体质差、合并脏器功能衰竭、不能耐受较大手术者。同时，我们亦同意赵锦等［23］的观点——即目前接受治疗的患者多为疾病晚期，由于患者长期存在高血糖、高血压、高血脂等多种综合危险因素，对患者自体骨髓干细胞移植的同时，进行血糖、血脂、血压达标的长期综合管理，随访期间督促患者长期正规服用抗凝药物，针对足溃疡进行规范化清创换药是提高治疗效果的手段。与以上研究不同的是，本研究以“生物-心理-社会”医学模式为导向，针对自体骨髓干细胞移植治疗下肢慢性缺血性疾病进行了临床研究，期间充分发挥了护理人员的主观能动性，积极采取有效的护理干预措施，维持患者的身心处于最佳状态，结果明显促进了患者的恢复，缩短了康复的时程，说明护理工作对于此类患者相当重要，提示全程医护配合有利于自体骨髓干细胞移植治疗的实施，是个体化治疗下肢慢性缺血性疾病的一种新的参考模式。

总之，用自体骨髓干细胞移植治疗下肢缺血性疾病在世界范围内仍属于试验阶段，其仍然存在以下问题:如治疗机制尚不完全明了;干细胞移植的最桂时机、移植方式、移植数量、移植种类及移植后在缺血组织内增生潜能及影响、控制因素，新生血管再狭窄的预防等。我们的观点是:鼓励大力开展基础及应用基础研究，科研性质的临床应用研究在部分有条件的医院可规范化开展。在疗效不确切的情况下，暂不主张在临床上大规模推广应用，更不主张以盈利为目的、夸大其词的商业化宣传。这主要是因为目前大多的临床研究样本小，需要进行更进一步的研究确定其临床治疗疗效及安全性。相信随着研究的深入，自体骨髓干细胞移植将会有进一步的发展，将为下肢动脉缺血性疾病治疗开辟新途径。

1 Al-Omran M，Tu JV，Johnston KW，et al.Out come of revascularization procedures for peripheral arterial occlusive disease in Ontario between 1991and 1998:a population-based study［J］.Vase Surg，2003，38(2):279-288.

2 陈静，林源，黄之杰，等.2型糖尿病合并下肢动脉粥样硬化危险因素分析［J］.中国全科医学，2011，14(9):2953.

3 李仕明.糖尿病足与相关并发症的诊治［M］.北京:人民卫生出版社，2002:2-3.

4 付汉东，张爱华，鲁艳，等.自体骨髓干细胞移植治疗糖尿病足患者血管内皮生长因子的表达及意义［J］.中国全科医学，2010，13(8):2554.

5 Kajiguchi M，Kondo T，Izawa H，et al.Safety and efficacy of autologous progenitor cell transplantation for therapeutic angiogenesis in patients with critical limb ischemia ［J］.Circ J，2007，71(2):196-201.

6 邓英光，张紫萍，余卫.丹参注射液联合骨髓干细胞移植治疗脑梗死肢体瘫痪的临床研究 ［J］.实用心脑肺血管病杂志，2012，20(3):424.

7 昝坤，耿德勤.脑血管疾病的干细胞移植和基因治疗 ［J］.中国医师进修杂志，2009，32(13):4-6.

8 叶英，万美荣，戴如飞，等.脑脊液诱导人间充质干细胞定向分化为神经干细胞神经前体细胞的研究 ［J］.国际麻醉学与复苏杂志，2009，30(5):394-398.

9 Ye Y，Zeng YM，Wan MR，et al.Induction of human bone marrow mesenchymal stem cells differentiation into neural-like cells using cerebrospinal fluid ［J］.Cell Biochem Biophys，2011，59(3):179-184.

10 曹志勇，刘涵，单君君，等.自体骨髓间充质源神经干细胞移植应用于中枢神经系统疾病7例［J］.中国组织工程研究与临床康复，2011(1):163-166.

11 胡小素，翟国钧，董国祥，等.下肢动脉硬化闭塞自体干细胞移植围手术期护理［J］.中国微创外科杂志，2006，6(11):840-841.

12 刘爽，自晓冬，苏丽娟.自体骨髓干细胞移植治疗下肢动脉硬化闭塞症病人的护理［J］.护理研究:中旬版，2007，21(10):2678-2679.

13 曾昭凡，唐新华，谷涌泉.自体骨髓单个核细胞移植治疗慢性下肢缺血的研究进展［J］.江西医学院学报，2009，49(5):126-127，130.

14 Tepper OM，Galiano RD，Kalka C，et al.Endothelial progenitor cells:the promise of vascular stem cells for plastic surgery［J］.Plast Reconstr Surg，2003，111(2):846-854.

15 Park S，Tepper OM，Galiano RD，et al.Selective recruitment of endothelial progenitor cells to ischemic tissues with increased neovascularization ［J］.Plast Reconstr Surg，2004，113(1):284-293.

16 Asahara T，Masuda H，Takahashi T，et al.Bone marrow origin of endothelial progenitor cells responsible for postnatal vasculogenesis in physiological and pathological neovascularization ［J］.Circ Res，1999，85(3):221-228.

17 Shintani S，Murohara T，Ikeda H，et al.Augmentation of postnatal neovascularization with autologous bone marrow transDlantation ［J］.Circulation，2001，103(6):897-903.

18 Murohara T，Ikeda H，Duan J，et al.Transplanted cord blood-derived endothelial precursor cells augment postnatal neovascularization ［J］. J Clin Invest， 2000， 105(11):1527-1536.

19 Kalka C，Masuda H，Takahashi T，et al.Transplantation of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(7):3422-3427.

20 Tateishi-Yuyama E，Matsubara H，Murohara T，et al.Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells:a pilot study and a randomised controlled trial［J］.Lancet，2002，360(9331):427-435.

21 谷涌泉.糖尿病下肢缺血的外科治疗进展［J］.临床外科杂志，2008，16(5):305-306.

22 谷涌泉.糖尿病足新进展［M］.北京:人民卫生出版社，2008:331-332.

23 赵锦，徐艳，王卓，等.自体骨髓干细胞移植治疗严重下肢动脉硬化闭塞症15例［J］.中国组织工程研究与临床康复，2009，13(40):7959-7963.