脂多糖、钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ抑制剂对TNBS诱导BALB/C小鼠炎症性肠病的影响

何小华，陈建勇

(1、江西省赣州市人民医院，赣州 330012；2、江西省人民医院消化内科，南昌 330006)

炎症性肠病(IBD)是一组慢性非特异性肠道炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎 (UC)和克罗恩病(CD)，病因和发病机制尚未完全明确，发病过程中有环境、遗传、免疫和感染等因素参与。近年来,随着人们生活方式的改变及诊断水平的提高，国内近十年报道炎症性肠病的发病率有逐年上升的趋势。其临床表现多样，并发症多，病程漫长，易反复发作，治疗缺乏特异性。因此，探讨其发病机制及寻找新的治疗手段具有十分重要的意义。本实验应用脂多糖、钙/钙调素依赖性蛋白激酶抑制剂KN62预先干预，再采用Fuss等[1]的方法并加以改进即三硝基苯磺酸(100mg/kg)乙醇溶液结肠灌注建立病理特征类似于人类IBD的动物模型，通过此模型观察和比较各组小鼠的疾病活动度指数、结肠黏膜病理组织学改变，并检测小鼠结肠粘膜内的IL-6mRNA含量和结肠固有层单个核细胞中MHC-Ⅱ类分子的表达情况，以探讨LPS、KN62对IBD的干预作用及其可能机制，为IBD的诊治提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料 6-8周龄健康雌性BALB/C小鼠40只，体质量(20±2)g，由南昌大学医学院实验动物科学中心提供。2,4,6-三硝基苯磺酸 (TNBS)、脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)KN62均为sigma公司产品；IL-6mRNA、β-actin引物合成(上海捷瑞生物技术有限公司)；鼠抗鼠H-2Ⅰ-Ab单克隆抗体、鼠抗鼠IgG抗体均为eBioscience公司产品。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和模型制备 将40只BALB/C小鼠按体质量随机编号分为4组，模型对照组(UC组)、脂多糖干预组(LPS组)、钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ抑制剂组(KN62组)、正常对照组(NC组)每组10只。各组小鼠禁食(不禁饮)24h，模型组小鼠在给予TNBS乙醇溶液灌肠前2h开始，UC组小鼠腹腔内注射0.9%氯化钠溶液，LPS组小鼠腹腔内注射脂多糖溶液 (5mg/kg)，KN62组小鼠腹腔内注射KN62溶液(25ng/小鼠)。干预后将连有1ml注射器4.0F导管经肛门插入结肠至导管顶端距肛门约4.5cm，各模型组灌注100μl TNBS乙醇溶液(5%TNBS溶液与100%乙醇分析醇1:1混合)，正常对照组灌注100μl 0.9%氯化钠溶液；拔出导管之后将小鼠倒置1min，动物恢复正常进食、饮水。

1.2.2 观察小鼠每天情况 称取体重、化验大便常规及隐血，参照Murano等[2]方法获得疾病活动指数(disease active index，DAI)；在结肠病变最明显处取组织标本作常规石蜡包埋、切片、HE染色，参照Ekstrom等[3]方法进行组织学损伤的评估(histological index，HI)。

1.2.3 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测结肠黏膜组织IL-6mRNA表达。

1.2.4 流式细胞术检测结肠黏膜固有层中单个核细胞MHC-Ⅱ类分子的表达。

1.3 统计学分析 所有统计学处理均采用SPSS13.0统计软件检验，数据表达采用()表示，组间两两比较采用LSD-t检验，设 α=0.05，以 P>0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠结肠炎症疾病活动评分 实验期间LPS组、UC组分别有2只小鼠因不能耐受而死亡。NC组小鼠反应灵活，食量正常，体重增加。各造模组小鼠于造模后第1d均出现反应迟钝、活动减少、喜扎堆、竖毛、皮毛无光泽、食量下降、稀便或大便松软、潜血(±-+++)、体质量下降等情况，第 2-3d 达到高峰，此后情况逐渐好转。4组DAI评分见表1。

表1 各组小鼠结肠炎症疾病活动指数评分(DAI)()

注：Pa<0.05 vs正常对照组(NC);Pb<0.05 vs模型对照组(UC);Pc<0.05 vs模型对照组(UC)。

组别 n DAI NC组UC组LPS组KN62组10088108.75±0.91a 10.68±1.16b 4.36±0.52c

2.2 结肠病理组织学损伤评估(HI)正常对照组小鼠结肠上皮完整，结构清晰，固有层杯状细胞丰富，腺体排列规则，无充血、水肿、溃疡，黏膜固有层可见少量疏松结缔组织，偶尔有微量淋巴细胞、中性粒细胞浸润；模型对照组小鼠可见部分腺体结构，有较大溃疡，黏膜固有层有大量炎性细胞浸润；脂多糖组表现为重度炎症，结肠全层增厚，粘膜层缺失，腺体结构基本消失，有多处深大溃疡，黏膜固有层可见大量淋巴细胞及嗜酸性粒细胞等炎细胞浸润；KN62组小鼠黏膜腺体轻度破坏，但大部分上皮结构仍完整，黏膜有局部充血、水肿及轻度糜烂，无溃疡形成，黏膜固有层有少量炎症细胞浸润。结果见表2。

2.3 各组小鼠结肠黏膜组织IL-6mRNA的表达水平 在各组β-actin条带的表达基本一致的情况下，观察IL-6mRNA条带的表达变化，并进行各组IL-6mRNA/β-actin条带的光密度比值的计算。结果如下：LPS组、UC组、NC组及 KN62组的 IL-6mRNA/β-actin条带光密度比值分别为 (0.71±0.25)、(0.53±0.21)、(0.14±0.12)、(0.38±0.13)。 两两比较，LPS组高于UC组，差异有统计学意义P<0.05，KN62组低于UC组，差异有统计学意义P<0.05。

表2 各组小鼠结肠病理组织学损伤评估(HI)()

表2 各组小鼠结肠病理组织学损伤评估(HI)()

注：Pa<0.05vs正常对照组(NC);Pb<0.05vs模型对照组(UC);Pc<0.05vs模型对照组(UC)。

组别 n HI NC组UC组LPS组KN62组1088101.80±0.5810.92±0.93a 3.54±1.12b 5.47±0.81c

2.4 各组小鼠结肠黏膜固有层单个核细胞MHC-Ⅱ类分子活性的表达 UC组小鼠MHC-Ⅱ类分子表达显著高于 NC 组[(4.97±0.23)vs(1.26±0.11)]，差异有统计学意义P<0.05，而LPS组、UC组、KN62组两两比较，结果分别为：LPS组表达高于UC组[(7.32±0.14(vs)4.97±0.23)]，差异有统计学意义 P<0.05，KN62 组低于 UC 组[(2.38±0.16)vs(4.97±0.23)]，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

随着医学研究的发展，动物实验模型研究已经占据极其重要的地位。选择与临床症状类似、重复性好、操作简单的动物模型，不仅为研究疾病的发生、发展规律提供重要依据，而且为治疗和开发研制新型药物提供合适的工具。虽然IBD发病机理尚不明确，但免疫反应在发病中起着重要作用已被普遍认同。制作炎症性肠病动物模型方法可谓多种多样，包括自发性结肠炎、转基因、特定基因敲除，T细胞移植型及化学药物诱导型等方法获得模型，其中免疫模型是IBD目前研究最活跃的领域。本实验主要采用灌肠的方式给予以乙醇为溶剂的TNBS溶液，刺激结肠产生炎症。应用100mg/kg体重TNBS乙醇溶液造模成功诱发出炎症性肠病，病变程度适中，造模剂量较合适，与国内外文献[4]报道一致。并且TNBS造模有周期短，操作简单，重复性好，成模率高，费用相对较低等优点，是研究IBD发病机制和观察药物疗效的较理想模型。脂多糖(LPS)是革兰阴性菌的细胞壁成分,亦称内毒素，属病原体相关分子模式(PAMP)，免疫刺激作用强。已证实脂多糖作用机制是通过TLR4-LPS介导的信号通路来实现的。Toll样受体4属于一种模式识别受体，也是介导内毒素应答的最主要受体，其表达的高低与细胞因子的释放具有直接的关系。脂多糖通过与巨噬细胞、内皮细胞等多种细胞膜上受体作用后，启动胞内信号传导系统，最终激活核转录因子-κB(NF-κB)，引起 TNF-α、IL-6、IFN-γ 等多种细胞因子和炎症介质的表达和释放，导致全身炎症反应形成。动物实验表明LPS模型的免疫病理特征是固有免疫反应过度激活，伴随释放大量的炎性细胞因子，其中IL-6、TNF-α被称为前炎症细胞因子，是启动全身炎症反应的关键细胞因子，炎症启动后可导致“瀑布样级联炎症反应”，激发产生继发性炎症介质。有研究显示IL-6可诱导炎症急性相蛋白合成，对炎性细胞有直接激活和毒性作用。另有研究证实IBD中存在IL-6高表达现象，血清及肠道黏膜明显增高的IL-6与病变范围和病变严重程度呈正相关。本实验显示给予较大剂量的脂多糖预处理后IL-6mRNA表达水平明显高于模型对照组，表明LPS诱导可明显增强细胞IL-6的转录水平，进而加重炎症性肠病动物模型炎症反应。

钙信号参与许多重要的生理过程。而作为钙信号的效应蛋白的钙/钙调素依赖性蛋白激酶，可通过磷酸化底物而参与许多信号通路的调节。有研究表明CaMKII可以通过结合并活化信号分子ASK1、Raf-1及TAK1来调控下游的MAPK，参与其他信号途径调控。而TAK1是TLR4信号通路MyD88依赖途径中的必需因子。另外，有研究报道，通过抑制CaMKII的活性，可降低血小板活化因子 (PAF)致敏的巨噬细胞中LPS诱导的ERK、JNK、NF-κB 的活化及TNF-α的产生。表明CaMKII选择性地参与TLR4信号转导的调控，并可能同时参与调控TLR4的MyD88依赖和MyD88非依赖途径的信号转导。主要组织相容性复合体(MHC)是一个高度多态性的基因群。MHC II类分子是表达在免疫系统特定细胞表面的由α链和β链非共价键相连组成的一组高度多态性的跨膜糖蛋白。这些分子把外源性抗原递呈给辅助性T细胞的抗原受体，导致辅助性T细胞的激活和分化，从而参与调控机体免疫应答，在免疫学上具有非常重要的意义。有实验证据显示CaMKII能调节DC的MHC II类分子的表达，抑制CaMKII的活化不但能增加MHC II类分子的溶酶体转运和降解，还能抑制MHC II mRNA的转录及稳定性。国外研究证实抗体交联MHC II类分子能诱导DC胞浆中钙流的上升，而利用特异的抑制剂抑制CaMKII的活性后可显著抑制细菌抗原诱导的DC的MHC II类分子的表达，表明Ca2+/CaMKII与MHC II类分子之间存在相互调控。我们的实验显示预先给予小鼠腹腔注射CaMKII抑制剂KN62后，小鼠结肠黏膜病理组织学评分、IL-6mRNA表达水平及MHC-II类分子表达显著低于模型对照组，提示利用KN62抑制CaMKII活性可显著降低小鼠巨噬细胞IL-6的产生及结肠黏膜固有层单核细胞MHC-II类分子表达，从而对机体产生一种保护作用。

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