锌预处理对辣椒素致痛模型小鼠脊髓锌分布的影响

朱广军，张莉，郭敏

(1.辽宁医学院组织胚胎学教研室，辽宁 锦州 121001;2.盘锦市第二人民医院，辽宁 盘锦 124000)

神经病理性疼痛(Neuropathic Pain，NPP)是继发于外周或中枢神经系统损伤后的一种慢性疾病状态，以痛觉的高反应性如痛觉过敏、痛觉超敏、感觉缺失及自发疼痛等为主要临床病理生理学特点［1－3］。随着社会老龄化，该疾病的发病率逐年增高，严重影响了患者的生存质量。因此，深入研究NPP 的发病机制从而探索有效的治疗措施已经成为神经科学研究的热点之一。近年来的研究发现，锌离子可能参与了NPP 的产生与维持，因此，为了深入研究锌参与NPP 的可能机制，本研究拟应用金属自显影技术，原子吸收光谱技术和图像分析技术检测辣椒素致痛模型小鼠脊髓后角锌的分布变化，并且检测锌预处理对辣椒素致痛模型小鼠脊髓后角锌分布的影响，从而为深入研究锌参与NPP发病机制提供基础的实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物分组与模型制备

8 周龄C57/BL6 小鼠48 只，雌雄各半，体重30～40 g，随机分为4 组: (1)对照组(Con):正常喂养(锌:30.0 mg/kg)2 w 后足底注射生理盐水;(2)N－CAP 组:正常喂养(锌:30.0 mg/kg)2 w 后足底注射辣椒素 (0.5%，5 μL);(3)L－CAP组:低锌喂养(锌:0.85 mg/kg)2 w后足底注射辣椒素(0.5%，5 μL);(4)H－CAP组:高锌喂养(饮用硫酸锌水溶液，227 mg/L)2 w 后足底注射辣椒素(0.5%，5 μL)。

1.2 原子吸收光谱技术

术后7 d，各组小鼠麻醉后取新鲜的腰5 节段脊髓组织，微波热能消化脊髓组织，3000 r/min离心10 min 后取上清液，进行原子吸收光谱检测。

1.3 金属自显影技术

小鼠腹腔注射硒酸钠(20 mg/kg)，存活1.5 h后将动物麻醉，2.5%的戊二醛经心脏灌流固定，取腰5 节段脊髓。后固定3 h，30%蔗糖4 ℃过夜，恒冷切片机制备10 μm 冰冻切片。切片置于孵育液(60 mL 阿拉伯胶、10 mL 柠檬酸缓冲液、15 mL对二苯酚和15 mL 乳化银)，26 ℃孵育60 min。常规脱水、透明和封片，光镜下观察。

1.4 图像分析与统计学处理

2 结 果

2.1 原子吸收光谱检测结果

原子吸收光谱检测结果显示，与对照组(Con组)比较，NPP 小鼠脊髓的锌含量均显著减少(P＜0.01)，高锌预处理(H－NPP 组)能提高脊髓的锌含量(P ＜0.01)，低锌预处理(H－NPP 组)则加重脊髓的缺锌状态(P ＜0.01)(图1)。

2.2 金属自显影技术染色结果

金属自显影染色阳性反应产物为棕黑色颗粒状。与对照组(Con 组)相比，H－CAP 组脊髓背侧角浅层的锌离子显著增多(P ＜0.01);而N－CAP 组和L－CAP 组脊髓背侧角浅层的锌离子均显著减少(P ＜0.01)。其中，L－CAP 组脊髓背侧角浅层的锌离子显著低于N－ CAP 组(P ＜0.01)(图2)。

2.3 图像分析结果

图像分析显示，与对照组(Con 组)比较，H－CAP 组的吸光度值显著降低(P ﹤0.01)，N－CAP 组和L－ CAP 组的吸光度值显著增加(P ﹤0.01)，其中L－ CAP 组的吸光度值最高(P ﹤0.01)(图3)。

3 讨 论

研究发现，NPP 的发病机制复杂，发病原因多样，近年来由于癌症等疾病的生存率提高，因此导致NPP 的发病率显著增加，高达1%［4－5］。NPP 通常呈慢性，可持续数周、数月甚至数年，严重影响患者的生活质量。由于NPP 的临床治疗目前仍缺乏有效措施，因此，仍需深入探讨NPP 的发病机制，从而为寻找NPP 治疗的有效方法而提供基础的实验依据。

研究发现，锌是机体重要的微量元素，它广泛分布于各种组织和器官中［6］，在大脑、小脑、脊髓、背根神经节和颈上神经节等神经系统中的分布尤其丰富［7－8］。这些锌离子主要分布于神经元胞体的核周质中或者是轴突终末的突触小泡内，参与蛋白质的合成或者伴随神经递质或神经调质的释放，从而可在神经活动中发挥着重要的作用。近年来的实验研究表明，锌可能与NPP 的产生与传递有着密不可分的关系。有研究［9－10］发现，锌离子能影响非NMDA 受体的表达与功能，而这个受体在伤害性刺激传导过程中起着非常重要的作用。Jo等［11］将动物的脊神经背根切断，用金属自显影技术发现在脊髓背侧角的浅层，锌离子的分布显著减少，同时伴随小鼠机械痛阈值的降低，小鼠出现痛觉过敏现象，推断锌可能参与了痛觉的传导。本研究中利用原子吸收光谱技术和金属自显影技术也发现，足底注射辣椒素后，小鼠脊髓组织中的锌显著减少，脊髓后角浅层的AMG 阳性颗粒显著减少，分析可能是由于辣椒素致痛时，大量锌离子伴随着神经递质在脊髓后角浅层释放，从而造成锌耗竭。

此外，研究发现，缺锌可以使NPP 模型动物的机械性痛阈值降低，动物出现痛觉过敏和痛觉超敏现象，提示NPP 时引起的脊髓后角浅层缺锌可能是导致异常痛的原因。那么给予锌预处理是否能改变脊髓后角中的锌的分布呢?本实验给予动物高锌或低锌预处理，结果发现:当给予高锌预处理时，NPP 模型动物脊髓中的锌含量增高;而给予低锌预处理时，NPP 模型动物脊髓中的锌含量降低，提示锌预处理能影响NPP 模型动物脊髓锌的分布。

本研究利用原子吸收光谱、金属自显影技术和图像分析技术观察了锌预处理对辣椒素致痛模型小鼠脊髓后角浅层锌离子分布的影响，结果发现足底注射辣椒素后，脊髓后角浅层的锌离子显著减少，提示锌与NPP 的产生与传导密切相关;此外，本实验还发现锌预处理可以改变锌离子在NPP 动物脊髓后角浅层的分布。本实验有望为进一步研究锌参与NPP 的形成机制提供基础的实验依据。

图1 各组小鼠脊髓锌的含量(mg/kg，，n=6)

图2 金属自显影染色显示锌在各组模型动物脊髓的分布

图3 各组小鼠脊髓的吸光度值(金属自显影染色图像分析，，n=6)

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