WNK1基因多态性与血管紧张素转换酶抑制剂降压疗效的相关性研究

刘洁琳，刘 雅，王佐广，王 皓，李 梅，王丽娟，温绍君

WNK1基因多态性与血管紧张素转换酶抑制剂降压疗效的相关性研究

刘洁琳，刘 雅，王佐广，王 皓，李 梅，王丽娟，温绍君

目的 探讨缺乏赖氨酸的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(WNK1)基因单核苷酸多态性与血管紧张素转换酶抑制剂 (ACEI)降压疗效的相关性。方法 选取新发的轻中度原发性高血压病患者121例，均来自北京市昌平地区的常住汉族人群。予以贝那普利口服治疗8周，对降压疗效进行评定。利用TaqMan MGB等位基因分型试剂盒检测患者WNK1基因多态性rs880054和rs2301880的分布频率。结果 患者rs880054位点和rs2301880位点不同基因型的降压疗效间差异有统计学意义 (P＜0.05)。rs880054位点不同基因型的舒张压 (DBP)降低幅度间差异有统计学意义 (P＜0.05)，收缩压 (SBP)降低幅度间差异无统计学意义 (P＞0.05);rs2301880位点不同基因型的DBP降低幅度间差异有统计学意义 (P＜0.05)，SBP降低幅度间差异无统计学意义 (P＞0.05)。rs880054位点不同基因型与经ACEI治疗后DBP的降低幅度有关 (R2=0.167，P＜0.001);rs2301880位点不同基因型同样与治疗后DBP的降低幅度有关(R2=0.080，P=0.003);未发现上述两位点与SBP降低幅度的相关性。结论 WNK1基因单核苷酸多态性可能与ACEI的降压疗效有关。

高血压;WNK1基因;多态性，单核苷酸;血管紧张素转换酶抑制剂

原发性高血压病 (essential hypertension，EH)是一种遗传因素与环境因素相互作用所致的多基因遗传性疾病［1］。有效的降压治疗可使脑卒中和心肌梗死的风险分别降低40%和15%［2］。血管紧张素转换酶抑制剂 (angiotension converting enzyme inhibitor，ACEI)作为一线降压药物，可通过抑制血管紧张素转换酶的作用，减少血管紧张素Ⅱ的生成，降低血压水平，但不同EH患者对于ACEI的疗效及不良反应存在个体差异和种族差异，这种差异与个体间的遗传异质性有一定关系［3］。血管紧张素Ⅱ的生物学效应除了收缩血管外，还包括调节肾小管的水钠重吸收和刺激醛固酮的分泌等。近期研究表明，血管紧张素Ⅱ增加水钠重吸收的作用部分是通过缺乏赖氨酸的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶－应激激活蛋白激酶 (WNKs－SPAK)依赖的途径来实现的［4］，因此我们推测除了肾素血管紧张素系统的基因外，缺乏赖氨酸的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(WNKs)基因可能也是影响ACEI降压疗效的候选基因之一。WNKs在人体内有4个亚型，即 WNK1、WNK2、WNK3和WNK4，WNKs可以调节所有阳离子 －Cl－转运载体，包括Na+－Cl－转运载体、K+－Cl－转运载体等。研究发现，WNK1基因内含子1的大片断缺失或在WNK4基因的高度保守区域发生错义突变可引起单基因性高血压——假性低醛固酮血症Ⅱ型［5］，这是一种少见的常染色体显性遗传病，表现为容量依赖性高血压，伴有高血钾、高氯性代谢性酸中毒、而无任何肾小球异常。故此，WNK1和WNK4基因被认为可能是EH的候选基因之一，目前有报道WNK1基因单核苷酸多态性rs880054(T/C)、rs2301880与EH发病相关［6］，但未见有关 WNK1基因多态性与ACEI降压敏感性的相关报道。本研究旨在探讨在中国汉族EH患者中，WNK1基因多态性rs880054(T/C)、rs2301880与ACEI类药物降压疗效的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2010年6—11月于北京市昌平区城区社区卫生服务中心就诊的EH患者。入选标准:汉族，无一、二级亲属关系;年龄18～79岁;未服用过任何抗高血压药物的新发EH患者;收缩压 (SBP)140～179 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，舒张压 (DBP)90～109 mm Hg;签署知情同意书同意参加本研究者。排除标准:SBP≥180 mm Hg和 (或)DBP≥110 mm Hg或因合并症复杂需联合用药的患者;单纯收缩期高血压、继发性高血压患者和肾动脉狭窄者;合并糖尿病，近1年内有心肌梗死、充血性心力衰竭 (心衰)、脑卒中或不稳定型心绞痛史者;肝肾功能不全者;患者不能遵守研究方案，如不能随访以及不能完成本研究。经过筛查共入选140例EH患者，其中有19例患者因为不能耐受的干咳、头痛等不良反应和用药期间新发冠心病和脑血管病而未完成随访，本研究最终完成了121例患者的随访，其中男49例，女72例;平均年龄为 (51±10)岁。

1.2 研究方法 所有入选患者经询问病史、体检并完成心电图、超声心动图、血尿常规和生化检查后，予以ACEI类药物贝那普利 (北京诺华制药有限公司，生产批号:H20000292)进行降压治疗。起始剂量为10 mg/d，每2周随访一次，测量血压并记录患者的用药感觉、不良反应 (如咳嗽、头晕、皮疹及水肿等);第4周末，如血压≥140/90 mm Hg，则剂量加倍。8周随访期结束后，按照卫生部制定的心血管药物临床研究指导原则对降压疗效进行评定，显效:DBP下降≥10 mm Hg并降至正常，或下降≥20 mm Hg;有效:DBP下降＜10 mm Hg并降至正常，或下降10～19 mm Hg，或SBP下降≥30 mm Hg;无效:未达到上述标准［7］。

1.3 基因多态性检测方法 采用EDTA抗凝的采血管收集入选患者的外周静脉血3～5 ml，保存于－20℃的冰箱中。采用改良的酚－氯仿法抽提基因组DNA。采用TaqMan MGB等位基因分型试剂盒 (含相应的探针和引物，购自美国ABI公司)，根据说明书操作，在9700型高通量荧光定量PCR仪上进行PCR反应，最后经ABI HT 7900型荧光扫描仪扫描。采用SDS 2.0图像分析软件Allelic Discrimination程序进行终点分析，通过检测不同等位基因所标的FAM和VIC荧光强度，判断各待测样本基因分型为野生纯合子、突变纯合子还是杂合子。

1.4 统计学方法 采用SPSS 15.0统计软件进行数据库建立和统计学分析。计量资料以 (±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验;计数资料的比较采用χ2检验;等级资料的比较采用Ridit分析;基因型与降压幅度的相关分析采用多元逐步回归分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。遗传学Hardy－Weinberg平衡检验采用χ2检验，使用网络程序 (http://ihg.gsf.de/cgi－bin/hw/hwa1.pl)进行数据统计，以P＜0.05为不符合遗传或基因平衡定律。

2 结果

2.1 基因型分布情况 在121例患者中，本研究成功检测到119例患者的rs880054位点和120例患者的rs2301880位点。各基因型患者的一般资料比较中，除rs2301880位点不同基因型的心率间差异有统计学意义 (P＜0.05)外，其余差异均无统计学意义 (P＞0.05，见表 1)。WNK1基因多态性rs880054、rs2301880的基因型分布见表2，对研究对象各位点的基因型分布进行Hardy－Weinberg平衡检验，结果显示均符合Hardy－Weinberg平衡 (rs880054:P=0.82;rs2301880:P=0.28)。

2.2 WNK1基因多态性与ACEI降压疗效的相关性 rs880054位点和rs2301880位点不同基因型的降压疗效间差异有统计学意义 (P＜0.05，见表2)。

rs880054位点不同基因型的DBP降低幅度间差异有统计学意义 (P＜0.05)，CC基因型与TT、TC基因型间差异均有统计学意义 (q值分别为4.427、3.189，P＜0.05)，TT与TC基因型间差异无统计学意义 (q=1.682，P＞0.05);不同基因型的 SBP降低幅度间差异无统计学意义 (P＞0.05)。rs2301880位点不同基因型的DBP降低幅度间差异有统计学意义 (P＜0.05)，CC基因型与CT、TT基因型间差异均有统计学意义 (q值分别为2.591、2.453，P＜0.05)，TT与CT基因型间差异无统计学意义 (q=1.134，P＞0.05);不同基因型的SBP降低幅度间差异无统计学意义 (P＞0.05，见表3)。

经多元逐步回归分析，对可能影响ACEI类药物降压疗效的因素进行校正，包括:年龄、性别、体质指数、吸烟、饮酒、心率、ACEI药物剂量、血脂、血糖和肝肾功能等生化指标，分别分析rs880054和rs2301880不同基因型与DBP、SBP降低幅度的相关性。结果显示:rs880054位点不同基因型与治疗后 DBP的降低幅度有关 (R2=0.167，P＜0.001);rs2301880位点不同基因型同样与经ACEI治疗后DBP的降低幅度有关 (R2=0.080，P=0.003);未发现上述两位点与SBP降低幅度的相关性。

表1 不同基因型患者的一般资料比较Table 1 Comparison of general condition among patients with different genotype

表2 不同基因型患者的降压疗效比较Table 2 Comparison of antihypertensive effects among patients with different genotype

表3 不同基因型患者的降压幅度比较 ±s，mm Hg)Table 3 Comparison of reduction of blood pressure among patients with different genotype

表3 不同基因型患者的降压幅度比较 ±s，mm Hg)Table 3 Comparison of reduction of blood pressure among patients with different genotype

例数 SBP降低幅度 DBP降低幅度rs880054 TT 55 20.0±11.9 13.4±5.7 TC 51 17.9± 9.7 11.4±6.2 CC 13 12.2±10.9 4.8±2.1 F 2.603 9.618 P值值0.079 0.000 rs2301880 CC 65 19.7±12.0 13.3±5.8 CT 47 17.4± 9.3 10.0±7.0 TT 8 13.0±10.6 7.6±2.3 F 1.482 4.879 P值值0.231 0.009

3 讨论

目前EH的治疗仍然是以药物降压为主。长期以来，高血压患者降压药物的选择主要根据临床经验和相关指南，然而不同个体对高血压药物治疗的反应有很大差异。尽管很多环境因素和非遗传因素如年龄、性别和基础血压水平等都可以影响降压治疗的效果，但越来越多的研究发现抗高血压药物疗效的个体差异与个体的基因变异密切相关，相关通路上的基因变异可以解释20% ～95%的药物反应个体差异［8－9］。因此有关高血压相关基因多态性与降压药物的疗效和不良反应的研究已成为众多研究者所关注的热点。应用基因多态性探讨高血压个体化治疗方案的基础与临床研究具有重要意义。

WNK1基因位于12号染色体上，全长160 kb，含有28个外显子。Tobin等［6］曾报道在欧洲白人中，位于WNK1基因第10内含子的rs880054位点和第23内含子的rs2301880位点与24 h平均SBP和DBP水平显著相关，rs2301880位点的最小等位基因频率为26%，TT型与CC型相比，24 h平均SBP水平低3.5 mm Hg以上。另外，最新研究显示，该基因除了参与调节水钠重吸收外，还可通过α1－肾上腺素能受体－Gαq/11蛋白通路收缩动脉血管［10］，进而参与高血压等心血管疾病的病理生理过程。由于Gαq/11蛋白通路也是血管紧张素Ⅱ导致血管收缩的信号通路之一，因此本研究探讨了WNK1基因上两个单核苷酸多态性rs880054和rs2301880与ACEI类药物降压疗效的相关性，结果显示上述两位点均与ACEI治疗后DBP的降低幅度有关，rs880054位点TT基因型患者和rs2301880位点CC基因型患者可能对ACEI类药物更敏感。

WNK1基因虽然不是ACEI类药物的靶基因，但有体外研究显示，血管紧张素Ⅱ可减轻WNK4对肾脏远曲小管和集合管上Na+－Cl－共转子 (NCC)的抑制作用，使得NCC活性增加，导致水钠潴留［11］。虽然目前尚无研究显示血管紧张素Ⅱ也是WNK1的上游调节因子，但由于WNK1也是通过抑制WNK4的作用导致钠氯重吸收增加的［12］，与血管紧张素Ⅱ的作用通路相同，此外ACEI除了抑制血管紧张素I向血管紧张素Ⅱ的转化外，还会减少血管紧张素Ⅱ的促醛固酮分泌作用，而醛固酮也是通过WNKs参与NCC磷酸化的级联反应［4］，导致水钠潴留的，因此我们推测WNK1基因的改变可能会与高血压患者对ACEI类药物降压反应的个体差异有关，本研究结果在一定程度上证实了此推测。

目前，有关rs880054和rs2301880位点增加高血压发病风险和影响ACEI类药物降压敏感性的机制还不清楚。虽然上述两个单核苷酸多态性均位于内含子，其变异不会导致编码蛋白质氨基酸序列的改变，但有研究证实位于基因内部的单核苷酸多态性可以通过影响基因的转录、转录后加工、翻译或者翻译后蛋白质产物的活性等影响基因的功能。还有一种可能是这两个单核苷酸多态性与具有启动子功能的单核苷酸多态性存在完全连锁不平衡从而改变WNK1蛋白的表达，但这均需要进一步的功能研究来证实。

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3 王佐广，彭晓云，李丽立，等.中国人ACE I/D基因多态性与高血压患者ACEI降压效果的meta分析 ［J］.中国现代医学杂志，2010，20(23):3566－3570.

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Correlation of WNK1 Gene Polymorphism with Antihyperactive Effect of Angiotensin Converting Enzyme Inhibitors

LIU Jie－lin，LIU Ya，WANG Zuo－guang，et al.Beijing Anzhen Hospital，Capital Medical University，Beijing 100029，China

ObjectiveTo investigate the correlation between the rs880054 and rs2301880 polymorphisms of the WNK1 gene and the blood pressure response to angiotensin－converting enzyme inhibitors(ACEI)in patients with essential hypertension.MethodsA total 121 patients with mild to moderate essential hypertension，who are Han nationality from a district of Beijing，were recruited.Oral Benazepril was administered to the patients for 8 weeks.Genotyping was performed to identify the polymorphisms of the WNK1 gene.ResultsThere was significant difference in antihyperactive effect between patients with rs880054 and rs2301880 polymorphisms of the WNK1 gene(P＜0.05).There was a significant difference between patients with rs880054 polymorphisms in reduction of diagnostic blood pressure(DBP)(P＜0.05)，but no significant difference in systolic blood pressure(SBP)(P＞0.05).There was a significant difference between patients with rs2301880 polymorphisms in reduction of DBP，but no significant difference in SBP(P＞0.05).After the treatment there were significant correlation between these two polymorphisms and the reductions in DBP(rs880054:R2=0.167，P ＜0.001;rs2301880:R2=0.080，P=0.003)，but no correlation was found in SBP.ConclusionThe rs880054 and the rs2301880 polymorphisms of the WNK1 gene may be associated with the antihyperactive effect of ACEI in patients with essential hypertension.

Hypertension;WNK1 gene;Polymorphism，single nucleotide;Angiotensin converting enzyme inhibitors

R 544.1

A

10.3969/j.issn.1007－9572.2013.02.012

北京市自然科学基金资助项目 (7102045，7120001)

100029北京市，首都医科大学附属北京安贞医院 北京市心肺血管疾病研究所高血压研究室

温绍君，100029北京市，首都医科大学附属北京安贞医院北京市心肺血管疾病研究所高血压研究室;

E－mail:wenshaojun@yahoo.com.cn

2012－11－28;

2013－01－05)

(本文编辑:闫行敏)