绿盲蝽在人工饲料模型上刺吸波形EPG解析

周延乐，赵秋剑，张永军，郭予元

(中国农业科学研究院植物保护研究所/植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193)

随着转Bt 基因棉花在我国的大面积种植，棉铃虫等靶标害虫得到了有效的控制，但广谱型农药使用量逐渐下降，使得棉田盲蝽发生数量剧增、为害加重，成为我国转基因棉田的主要害虫(Wu et al.，2002;郭建英等，2005;Wu and Guo，2005;Lu et al.，2010)。

刺吸波技术(Electrical Penetration Graph，EPG)是20世纪80年代末发展成熟的一种研究植食性刺吸式昆虫在寄主植物上刺探、取食行为的一种技术手段(蔡晓明，2008)。EPG 技术能够长时间连续监测刺吸式口器昆虫的刺探行为，可以用来判断目标昆虫对寄主的喜好程度，为鉴定寄主植物抗虫性等提供依据。EPG 技术与视频技术联用，明显地提高了分析效率(罗晨等，2005)。该技术提供了一种精确直观研究刺吸式昆虫取食行为的方式，能定量研究昆虫在植物组织内部分泌唾液和刺吸汁液等取食行为。2002年Cline和Backus 首次利用AC－EPG和录像设备研究了美洲牧草盲蝽Lygus hesperus Knight 在人工饲料上的取食行为，成功记录了7种取食波形和20 多种非取食波形，其刺探波大致可分为A、B、C1、C2、F波等几类。短暂的A 波表示口针的刺入;不规则的B 波表示口针在撕裂寄主植物的组织和向外分泌唾液;规则的C1、C2波表示取食(Cline and Backus，2002)。目前采用EPG 开展的研究范围已经扩展到寄主植物的选择性、昆虫传毒机制和植物抗虫机制以及内吸性农药的测定等行为生态学领域，研究的对象也由最初的蚜虫扩展到粉虱、叶蝉、蓟马、盲蝽等大多数刺吸式昆虫(岳梅等，2005)。本文采用EPG 技术结合视频观察解析了绿盲蝽在人工饲料模型上的刺吸取食行为与对应EPG 波形关系，以期为明确绿盲蝽 Apolygus lucorum(Meyer－Dür)寄主取食行为机制提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

绿盲蝽采自中国农业科学院植物保护研究所廊坊科研中试基地棉田，室内采用新鲜四季豆饲养5代，未施用任何杀虫剂。室内饲养条件为温度28℃，相对湿度为60%，光照周期为16∶8(L∶D)。选取当日蜕皮的4龄若虫为测试昆虫，测定前饥饿6 h。

1.2 人工饲料模型

在一个长×宽×厚为6 cm×6 cm×0.6 cm的树脂玻璃上设计一个直径为4 cm，厚度为0.5 cm 的圆槽。圆槽中间放入4mL 含5%蔗糖的新鲜四季豆汁溶液作为人工食料，四季豆汁溶液由20 g 新鲜的四季豆和200mL 蒸馏水放入多功能搅拌机中搅碎取上清制成。连接导电铜丝后用拉伸的Parafilm 封口(图1)。

图1 a:饲料模型正面;b:饲料模型侧面(仿Joost et al.，2006)Fig.1 a:Frontal view of artificial diet model;b:Side view of artificial diet model

1.3 刺吸电位波形记录及行为观察

刺吸电位电位仪Giga－8 DC－EPG 购自荷兰。昆虫电极为细铜丝，铜丝的顶端用导电胶连接长约3 cm，直径20 μm 的金丝。采用CO2麻醉饥饿后的绿盲蝽4龄若虫使其背部朝上，把昆虫电极的金丝一端蘸取适量导电胶，迅速粘结于绿盲蝽的前胸背板末端。将粘结于EPG 电极金丝之上的绿盲蝽转移移至人工饲料模型Parafilm 表面，并保持一定的活动范围，将模型置于体视显微镜的目镜视野内。体视显微镜目镜端连接摄像机并通过USB 线将数据传输至电脑。刺吸电位波形数据自动采集并存储，采用ANA 34 软件进行波形分析以及数据整理。通过体视显微镜，结合电脑视频软件，使观察到的图像与EPG 所对应的波形同步，并进行连续观察。每头绿盲蝽只测试1次，每次采集6 h，每种波形成功记录50次(图2)。

图2 绿盲蝽在人工饲料模型上的EPG 记录及行为观察装置(仿Joost et al.，2006)Fig.2 Equipment configuration for split screen video of A.lucorum sucking behavior and EPG waveforms

2 结果与分析

依据体视显微镜观察到绿盲蝽实时取食行为(图3)及对应的刺吸波形，绿盲蝽在人工饲料模型上的EPG 波形可分为4种:口针刺入(图4a)，即绿盲蝽口针刺破Parafilm 进入人工饲料溶液的过程中，波形突然下降，中间有短暂的变化后维持在一个相对平稳的状态，刺入过程持续时间较短(0.1～0.2 s);口针搅动(图4b)，即绿盲蝽口针在人工饲料内搅动的过程(4～5 s)，波形出现高频率剧烈变化，伴随着搅动过程，波形变化明显;绿盲蝽口针在人工饲料内上下抽动(图4c)，此阶段持续时间较长(19～35 s)，波形也出现剧烈变化，但变化的过程有一定的间隔;口针拔出(图4d)，在绿盲蝽口针拔出过程中波形有一个先下降的趋势，然后在恢复到刺探前水平，拨出过程很快(0.1～0.2 s)。另外，试验中未观察到非刺探波形。

3 结论与讨论

长期以来，盲蝽一直属于棉花上的次要害虫，因而对于它的研究相对较少。相对薄弱的生物学研究基础不能满足日益严峻的盲蝽防控和综合治理的需求。近几年，盲蝽危害导致的棉花产量损失常达20%～30%，严重地区则高达50%。棉田盲蝽的种群爆发还波及了枣、葡萄、苹果、桃、樱桃、梨、茶树等多种作物(陆宴辉和吴孔明，2008)。盲蝽的防治已经成为影响我国多种农作物生产的重要制约因子。对于盲蝽取食习性和行为的研究，可以为盲蝽的综合治理提供一定的理论基础。

通过实时记录和观察绿盲蝽在人工饲料模型上的EPG 波形及对应刺吸行为，初步归纳获得了绿盲蝽在食物模型上EPG 波形的生物学意义。赵秋剑等(2011)采用Giga－8 DC－EPG 采集绿盲蝽在14个棉花品种(系)上的取食行为，发现其EPG 波形分为5种:A 波为刺探波，H 波为口针在组织内刺探，M 波为口针在组织内破碎细胞并分泌唾液波，B 波为吸取混合物以及口针停留后拔出，NP 波为喙和口针停留在叶片表面并未刺入。本文发现绿盲蝽在食物模型上有4个取食波形，分别为口针刺入、口针搅动、口针上下抽动、口针拔出行为对应的波形。这与赵秋剑等报道基本吻合，但未观察到非刺探波形。由于昆虫的取食和多种因素有关，虽然昆虫的视觉和嗅觉对选择寄主植物有一定的影响，但昆虫落到植物上后，口针所探测到的各种信息，包括叶表和叶组织内部的物理、化学信息，对最终决定是否取食该植物具有重要的作用。从叶表到韧皮部，昆虫的感受器可以探测到各种不同的化学信息，导致不同的取食反应。如叶表的糖和生物碱，叶肉的多糖和pH 梯度以及韧皮部的氨基酸、蛋白质、碳水化合物、次生物质还有叶肉的结构对昆虫接受寄主均有重要作用(Lei and Xu，1995)。人工饲料模型由于没有外部蜡质层、茸毛等物理因素，绿盲蝽的口针可能不需要在Parafilm 表面进行刺吸取食前停留。相比之下，人工饲料模型内部也没有复杂的结构，获得EPG 波形相对较少，但在一定程度上可以揭示昆虫的取食行为(Joost et al.，2006)。波形与昆虫刺探、取食行为之间对应关系的深入研究，必须借助一定的研究方法，如组织学技术、蜜露化学成分分析、生物染色液处理植物根系、观察植物表面残留口针中有无汁液溢出、直接观察人工食物中口针的行踪及直接观察昆虫口针在植物组织中的行踪和利用放射性同位素技术等(陈建明等，2002)。EPG 研究与电镜及视频技术的结合，为明确口针的刺探部位与波形的对应关系奠定了基础。Kimmins和Tjallingii(1985)在对甘蓝蚜Brevicoryne brassicae(L.)的研究中，将EPG 与电镜技术结合，将蚜虫的口针切除，发现只有发生韧皮部的波形(E 波)后切断口针才会有汁液流出，并从显微照片上看出，口针顶端已经刺穿筛管的原生质膜和细胞内腔。研究人员在记录B 型烟粉虱的取食行为中发现下唇的缩短长度与口针进入植物组织的长度一致。结合高放大率摄像机，在分屏的屏幕上可以同时看到粉虱下唇和EPG 波形，下唇长度的改变可以被测定并与特定的EPG 波形相结合，因此某一特定的波形发生时，口针进入植物组织的长度就可以被测量出来(Jiang and Walker，2001)。本研究中使用的体视显微镜及人工饲料模型，可以直观的观察绿盲蝽实时取食行为，省去作组织切片观察目标昆虫口针位置的繁琐过程。

EPG 技术在刺吸式昆虫与植物相互关系、植物抗性机理及昆虫传毒机理研究中发挥着越来越重要的作用。植物的抗虫性一直被誉为最有效、最经济的害虫防治措施，筛选对盲蝽具有较高抗性的棉花品种也具有重要意义。解析绿盲蝽在食料模型上波形，为今后抗性品种的筛选鉴定奠定了一定的基础。

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