喷司他丁发酵条件的优化

邹 昕

福建省微生物研究所，福州350007

喷司他丁发酵条件的优化

邹 昕

福建省微生物研究所，福州350007

喷司他丁是一种抗肿瘤药物，主要以微生物发酵法生产。本研究对喷司他丁发酵的通气量、培养温度、接种量、种龄、发酵周期等参数进行单因素考察，并通过正交试验确定了喷司他丁最佳发酵参数为：装量60 mL，种龄42 h，按5%接种量，28℃下发酵168 h，喷司他丁发酵效价达183μg／mL，比对照提高20%以上。

喷司他丁；发酵；工艺；正交试验

喷司他丁（pentostatin）是 1974年 Warner⁃Lambert等［1］从 土 壤 微 生 物 Streptomyces antibioticus中分离得到的一种拟嘌呤类的抗肿瘤药，为白色结晶。该药物于1992年首先在美国上市，1998年2月美国FDA正式批准注射粉针制剂喷司他丁上市。喷司他丁可用于治疗干细胞白血病、慢性淋细胞白血病和覃样霉菌病等，其作用机制为：通过抑制人体内的腺苷脱氨酶（ADA）活性，使肿瘤细胞大量积累脱氧腺苷和5′⁃三磷酸脱氧腺苷（dATP），从而抑制DNA或RNA的合成，最终导致肿瘤细胞的死亡［2］。近年来的研究表明，喷司他丁不仅是有效的抗肿瘤药物，而且可能是很有前途的免疫抑制剂［3］。如采用喷司他丁与Rituximab联合应用治疗低度恶性B细胞淋巴瘤，初步结果显示其有效率（CR＋PR）达70%，尚有15%患者稳定（SD），且患者容易耐受［4］。美国研究人员还发现采用喷司他丁结合紫外线治疗有助于肿瘤病人骨髓移植［4］。美国SuperGen公司最近宣布，临床研究显示，喷司他丁可以有效治疗儿童慢性移植物抗宿主病（cGVHD），由于疗效显著目前在市场运用越来越广泛，目前对其适应症的研究还在不断进行［5，6］。

目前已报到的喷司他丁的制备方法有两种，微生物发酵法和化学合成法［7］。两种制备方法各有优劣，但以微生物发酵法更为经济，现阶段国内以微生物发酵法为主。微生物发酵法产量的高低不仅取决于菌株的单位水平、培养基的组成，还与发酵的培养条件有很大的关系［8～12］。本文在对喷司他丁微生物发酵的温度、装量、接种量、种龄、发酵周期的单因素研究基础上，采用正交实验来获取最佳的培养条件，减少实验次数，提高工艺优化的效率，最终提高了喷司他丁的发酵产量。

1 材料和方法

1．1 菌种和培养基

喷司他丁产生菌（Streptomyces antiboticus）FIM06⁃063，由福建省微生物研究所提供。

1．2 培养基［13，14］

斜面培养基：葡萄糖10 g／L，酪蛋白3 g／L，酵母粉3 g／L，琼脂15 g／L。使用茄子瓶分装培养基，121℃蒸汽灭菌30 min，灭菌后将茄子瓶倾斜摆放，制成斜面。

种子培养基：葡萄糖10 g／L，酪蛋白3 g／L，酵母粉3 g／L。分装于500mL三角瓶中，121℃蒸汽灭菌30 min备用。

发酵培养基：葡萄糖3 g／L，黄豆粉35 g／L，酵母粉2．5 g／L，碳酸钙3．5 g／L，棉子油7．5 g／L。分装于500 mL三角瓶中，121℃蒸汽灭菌30 min备用。

1．3 喷司他丁产生菌的发酵

在无菌操作环境下，用无菌不锈钢勺从喷司他丁沙土管中取少许沙土，涂布在空白茄子瓶斜面上，涂抹时要均匀，使其生长一致，塞好棉塞。斜面于28℃培养15 h。取生长良好的茄子瓶菌种斜面，用接种针刮取斜面上的孢子至摇瓶种子瓶中，每瓶的孢子刮取面积约为1 cm2，摇瓶培养一定的时间后再接入发酵培养基的三角瓶中摇瓶培养。摇瓶的基本发酵条件为：28℃、200 r／min摇床振荡培养，每瓶装60 mL培养基，种子培养54 h，发酵接种量为5mL／60mL（7．7%），发酵周期144 h。

1．4 发酵条件的优化

1．4．1 单因素考察 分别考察温度、装量、接种量、种龄和发酵周期5个不同因素对发酵的结果影响［15～17］。温度设置 24℃、26℃、28℃、30℃和32℃共5个处理，考察温度对发酵的影响。装量不同对应不同通气量水平，在500 mL三角瓶中分别加入30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL、100 mL、110 mL和120 mL发酵液进行培养，获得最佳装量水平。接种量考察了1mL／60mL（1．6%）、2mL／60mL（3．2%）、3mL／60mL（4．8%）、 4mL／60mL （6．2%）、 5mL／60mL（7．7%）、7．5mL／60mL （11%）、10mL／60mL（14%）和12mL／60mL（17%）共8个不同水平，确定最佳接种量。种龄试验分别选用36 h、42 h、48 h、54 h、60 h、66 h、72 h和78h共8个处理进行试验，考察种子培养时间对发酵效价的影响。发酵周期试验分别在48 h、60 h、72 h、84 h、96 h、108 h、120 h、132 h、144 h、156 h、168 h、180 h、192 h、204 h和216 h时取样进行效价考察，由此确定最佳发酵周期。

1．4．2 正交实验 在28℃条件下，对装量、种龄、接种量、发酵周期4因素，取单因素实验中最佳3种结果为不同水平，进行L9（34）正交试验，进行喷司他丁发酵效价检测［18］，确定最佳发酵参数。

1．5 发酵效价的测定

采用高效液相色谱法（HPLC）测定发酵液中喷司他丁的效价。

1．5．1 样品制备 取10 mL发酵液，用中速定性滤纸初滤后吸取1mL滤液于50mL容量瓶中，加流动相定容，混匀，用0．45μm膜过滤，滤液即为HPLC测定样品［19，20］。

1．5．2 HPLC测定条件 实验采用岛津公司产10AVp型高效液相色谱仪，色谱柱为250 mm× 4．6 mm，5μm，C8色谱柱（Phenomenex公司），预柱为4 mm×3．0 mm，C8色谱柱（Phenomenex公司）。精密吸取样品溶液10μL注入高效液相色谱仪，柱温20℃，流动相为：磷酸氢二铵∶甲醇∶乙腈＝950∶25∶25［21，22］，流速为1．0 mL／min，紫外282 nm和270 nm双波长检测。

1．5．3 标准曲线的制作 将喷司他丁标准谱系列稀释后进行 HPLC测定，制作标准曲线，见图1。

图1 喷司他丁HPLC标准曲线Fig．1 Pentostatin HPLC standard curve．

1．5．4 样品的测定 发酵液样品进行HPLC测定，记录色谱图，喷司他丁的保留时间为8．5 min左右，按面积归一法，根据标准曲线，计算发酵液中喷司他丁的效价，发酵液HPLC色谱图见图2。

2 结果与分析

2．1 最佳温度的选择

比较不同温度条件下喷司他丁发酵的情况，设置24℃、26℃、28℃、30℃和32℃共5种温度条件，其他培养条件不变实验结果见图3。温度对效价的影响明显，在24℃～26℃区间，效价增长明显，28℃时达到最大。温度超过30℃后效价迅速下降。可初步确定26～28℃温度区间是喷司他丁产生菌的最适发酵温度区间。

2．2 最佳通气量的选择

喷司他丁产生菌（菌种名称）为好氧微生物，菌体在自身生长、繁殖及合成次级代谢产物的过程中都需要一定量氧气。发酵罐上可以通过调节空气流量和不同的搅拌转速来控制通气量［23］，实验室摇瓶发酵则通过控制摇床转速和改变摇瓶装液量来模拟不同的通气量。在其他基本发酵条件不变的情况下，分别在500 mL三角瓶中加入30～120 mL发酵培养基，在固定转速200 r／min的摇床上进行培养，考察通气量对发酵效价影响，实验结果见图4。装量在30～60mL时，效价曲线比较平稳，呈现一个上升趋势，当装量超过60mL后下降趋势明显。可见，喷司他丁产生菌的发酵对通气量有一定需求，但通气量并非越高越好，过大会造成菌丝早衰而断裂成碎片，发酵提前终止的现象。因此60 mL是比较适合的装量。

图2 喷司他丁发酵液HPLC色谱图Fig．2 HPLC chromatograms of pentostatin fermention broth．

图3 温度对喷司他丁发酵的影响Fig．3 Effect of temperature on pentostatin fermentation．

图4 通气量对喷司他丁发酵的影响Fig．4 Effect of ventilation on pentostatin fermentation．

2．3 最佳接种量的选择

在发酵过程中，接种量影响发酵液中的菌浓度。将喷司他丁种子液按不同接种量（1．6%～17%）接入发酵培养基中，考察接种量对发酵的影响，实验结果见图5。当接种量为1．6%～4．8%时，效价平稳增加，接种量超过4．8%后，效价逐步下降，初步确定3mL／60mL（4．8%）为最佳的接种量。

图5 接种量对喷司他丁发酵的影响Fig．5 Effect of inoculum volume on pentostatin fermentation．

2．4 最佳种龄的选择

种龄过长或过短都将直接影响发酵水平。种龄过长会引起菌体过早自溶，导致产物生产能力下降；种龄过短，会造成发酵菌丝生长缓慢，发酵周期延迟，增加动力消耗。喷司他丁的种龄试验分别选用36～78 h的种子进行试验，在其他发酵条件不变的情况下，考察种子培养时间对发酵的影响，实验结果见图6。由图6可以看出，喷司他丁种子液培养42 h可获得最高效价，初步确定42 h为最佳的种龄。

图6 种龄对喷司他丁发酵的影响Fig．6 Effect of seed age on pentostatin fermentation．

2．5 最佳发酵周期的选择

最佳发酵周期的确定就是选择发酵罐放罐的最佳时机。一般认为发酵周期的确定有三个原则：发酵目标产物的最大化；发酵成本的最低；对后续提取最有利。喷司他丁最佳发酵周期试验选择48～216 h中取样检测喷司他丁的发酵效价，实验结果见图7。可以看出，发酵周期在168 h时效价最高，之后效价后迅速下降，说明产物的分解也非常迅速。所以，168 h可做为最佳发酵周期。在工业发酵生产中，最佳发酵周期除了考虑获取最高效价外还需考虑到对发酵液后续提取最有利和最低发酵成本等因素，还需根据具体情况调整。

图7 发酵周期对喷司他丁发酵的影响Fig．7 Effect of time on pentostatin fermentation．

2．6 发酵工艺的正交试验

正交试验是基于数理统计学原理科学合理的安排实验，并按一定规律分析处理实验结果，从而能较快的找到工艺的最佳条件，且具有可判断诸多因素中何种因素是主要因素，以及判断影响因素之间的相互影响情况等优点。根据单因素实验结果，设置L9（34）正交试验，温度选择28℃，考察的四因素为装量、种龄、接种量和发酵周期，各因素选择三水平，见表1，正交实验结果见表2和表3。

表1 正交试验的水平和因素Table 1 Levels and factors orthogonal test．

从表2中的数据结果可以看出，极差值RC＞RA＞RB＞RD，由此可见对喷司他丁效价影响最大的因素是接种量，其次是装量（通气量），再次是种龄和发酵周期。比较K值，最佳组合为A2B2C2D3，即装量60 mL，种龄42 h，接种量5%，发酵周期168 h。由表3方差分析可知，接种量是影响喷司他丁发酵效价的极显著因素，另外装量是影响喷司他丁发酵效价的显著因素，而种龄和发酵周期对喷司他丁发酵影响不显著。极差和方差分析结果相互映证。

表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal experiment．

表3 正交试验方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment．

2．7 喷司他丁的发酵

按最佳条件进行发酵工艺验证试验，试验重复3次，喷司他丁效价测定结果见表4。在未改进发酵条件下的喷司他丁对照组效价为151（μg／mL），优化后发酵条件后喷司他丁效价为183（μg／mL），比对照组提高了20%以上。

表4 喷司他丁优化发酵工艺验证实验结果Table 4 Pentostatin fermentation result after optimization of fermentiation process．

3 讨论

pH、温度、装量、接种量、种龄和发酵周期等是发酵过程中的重要参数，对产物效价有直接影响。本研究未考察pH的影响，对其他因素逐一进行了单因素实验考察，发现最佳温度为28℃，最佳装量为60 mL，最佳接种量为4．8%，最佳种龄为42 h，发酵周期为168 h。通过运用L9（34）正交试验进一步确定了喷司他丁最佳发酵条件，优化条件下，喷司他丁的效价达183μg／mL，比未优化前提高了20%，有助于进一步扩大实验规模，进入中试生产，为喷司他丁的生产应用积累数据资料。

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Optim ization of Pentostatin Fermentation Conditions

ZOU Xin
Fujian Institute ofMicrobiology，Fuzhou 350007，China

Pentostatin is an anticancer drug，mainly produced by microbial fermentation．In this study，fermentation ventilation，temperature，inoculum，seed age，and other parameters of the fermentation cycle were discussed，then a orthogonal experiment was done to determine the optimum fermentation parameters：loading volume of60mL，seed age of42 h，5%inoculum，28℃for 168 h fermentation，pentostatin fermentation titer reached 183μg／mL，which was increased by 20%compared to the control．

pentostatin；fermentation；technology；orthogonal experiment

10．3969／j．issn．2095⁃2341．2013．05．12

2013⁃05⁃22；接受日期：2013⁃08⁃22

邹昕，工程师，研究方向为免疫抑制剂微生物发酵。E⁃mail：fjfzzouxin＠126．com