不同炮制方法对水蛭中氨基酸及抗凝血酶活性的影响

王雨林，王实强，刘玉琴，2，谢 谊

（1.湖南省中医药研究院中药研究所，湖南 长沙410013；2.湖南中医药大学，湖南 长沙410208）

水蛭是传统的破血逐瘀药，始载于《神农本草经》，2010年版《中华人民共和国药典》（一部）收载供药用的为水蛭科动物蚂蟥Whitmania pigra Whitman、水蛭Hirudo nipponica Whitman或柳叶蚂蟥Whitmania acranulata Whitman的干燥全体[1]。水蛭的主流商品为蚂蟥和柳叶蚂蟥，为了防止其入腹生子、降低毒性、矫嗅矫味等，多以炮制入药[2]，本文通过对水蛭不同炮制品的氨基酸及抗凝血酶活性进行测定，为水蛭的传统炮制工艺提供科学的实验依据。

1 实验材料

1.1 仪器

岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪，SPD-10Avp紫外可见检测器，N2000数据工作站；真空干燥箱DZF-6050(上海精宏实验设备有限公司)；AE240型分析天平(METTLER公司)；TGH-16C离心机（上海安亭科学仪器厂）；PHS-3C型精密pH计（上海精密科学仪器有限公司）。

1.2 试药

湖南产水蛭3批（长沙高桥药材大市场），经湖南省中医药研究院中药研究所生药室谢昭明研究员鉴定，1批为水蛭科动物蚂蟥Whitmania pigra Whitman的干燥全体；2、3批为柳叶蚂蟥Whitmania acranulata Whitman的干燥全体。牛纤维蛋白原(100 mg)、牛凝血酶(1 000 U)（Sigma公司）；对照品：L-谷 氨 酸 （140690-200401）、L-羟 脯 氨 酸（111578-200201）、甘氨酸（110735-200102）、L-丙氨酸（140680-200401）（均为中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用)；其他11种氨基酸对照品为均生化试剂：L-天冬氨酸（天津市科密欧化学试剂有限公司）；L-组氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸（国药集团化学试剂有限公司）；L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸（天津市光复精细化工研究所）；乙腈为色谱纯；异硫氰酸苯酯、三羟甲基氨基甲烷及其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 水蛭的炮制[3]

2.1.1 生水蛭 拣净杂质，用水洗净，切成3～5分长节段、干燥、粉碎，过40目筛。

2.1.2 滑石粉炒法 将滑石粉置锅内加热炒至灵活状态，投入水蛭段200 g，不断翻动，使其鼓起，筛去滑石粉水蛭放凉后，粉碎，过40目筛。

2.1.3 砂炒水蛭 取细砂置于锅内加热均匀，再加入净水蛭200 g，用文火炒至鼓起，酥脆，筛去细砂，水蛭放凉后，粉碎，过40目筛。

2.1.4 酒炙水蛭 取净水蛭200 g，加酒20 mL，拌匀，闷透，置锅内，用文火炒干，取出放凉，粉碎，过40目筛。

2.1.5 醋炙水蛭 取净水蛭200 g，加醋30 mL，拌匀，闷透，置锅内，用文火炒干，取出，放凉，粉碎，过40目筛。

2.1.6 蜜麸炒制法 取净水蛭200 g，加酒20 mL，喷匀，闷润1 h，另将蜜制麦麸置锅内炒至略起烟，即投入水蛭共炒，不断翻动，拌炒至水蛭表面棕黄色时取出，迅速倒入容器内，上盖麻袋焖5～10 min，筛去麦麸，摊凉。

2.2 柱前衍生HPLC法测定水蛭不同炮制品中氨基酸的含量[4]

2.2.1 色谱条件和系统适用性试验 色谱柱：Hypersil ODS2 C18色 谱 柱 （4.6 mm×200 mm，5μm）；流动相：以乙腈-0.1 mol/L醋酸钠溶液（3∶97）为流动相A（用冰醋酸调节pH值至6.5），以乙腈-水（4∶1）为流动相B，按表1进行梯度洗脱。检测波长：254 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；进样量：5μL。理论塔板数：按甘氨酸峰计算应不低于4 000。

表1 流动相洗脱梯度

2.2.2 供试品溶液的制备 （1）完全酸水解氨基酸样品制备 取水蛭粉末0.1 g精密称于安瓿瓶中，加6 mol/L盐酸5 mL，置酒精喷灯上拉丝封口，超声30 min使其溶解，置入烤箱中，150℃水解1 h。放冷，移入蒸发皿中，用10 mL水分次洗涤，洗液并入蒸发皿，水浴蒸干。残渣加0.1 mol/L盐酸溶解，转移至100 mL量瓶中，加0.1 mol/L盐酸稀释至刻度，摇匀，即得。（2）游离氨基酸样品制备 取水蛭粉末1.0 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加0.1 mol/L盐酸适量，超声处理（250 W，50 Hz）30 min，冷却放至室温，加0.1 mol/L盐酸稀释至刻度，摇匀，离心（3 000 r/min）10 min，取上清液，滤膜滤过，取续滤液即得。

2.2.3 混合氨基酸对照品溶液的制备 分别精密称取天门冬氨基酸等14种氨基酸对照品适量，加0.1 mol/L盐酸制成每1 mL分别含天门冬氨基酸0.097 2 mg、谷氨酸0.135 2 mg、羟脯氨酸0.043 6 mg、丝氨酸0.044 8 mg、甘氨酸0.073 2 mg、苏氨酸0.033 6 mg、丙氨酸0.054 mg、酪氨酸0.024 mg、缬氨酸0.029 6 mg、甲硫氨酸0.022 mg、异亮氨酸0.023 6 mg、亮氨酸0.069 6 mg、苯丙氨酸0.023 6 mg、赖氨酸0.103 2 mg的混合对照品溶液。

2.2.4 衍生化 取对照品溶液和供试品溶液各2 mL，分别置10 mL离心管中，加入0.1 mol/L异硫氰酸苯酯（PITC）乙腈溶液1.0 mL，1 mol/L三乙胺乙腈溶液1.0 mL，漩涡混合1 min，室温放置1 h后，加入4 mL正已烷，漩涡混合1 min后，放置10 min，取下层溶液，滤过，即得。

2.2.5 测定法 分别吸取各衍生化溶液5μL，注入高效液相色谱仪中，记录色谱图，计算氨基酸含量即得。结果见表2，高效液相色谱图见图1。

2.3 凝血酶滴定法测定水蛭不同炮制品中抗凝血酶活性

取水蛭粉末(过40目筛)约1.0 g，精密称定，精密加入0.9%氯化钠5 mL，充分搅拌，浸提30 min，并时时振摇，调pH值至5.0，离心，精密量取上清液100μL，置试管(8 mm×38 mm)中，加入含0.5%牛纤维蛋白原(以凝同物计)的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(取0.2 mol/L三羟甲基氨基甲烷25 mL与0.1 mol/L盐酸约40 mL，加水100 mL，调节pH 7.4)200μL摇匀，置水浴(37±0.5)℃中缓缓滴加每1 mL中含10 U的凝血酶溶液(每4 min滴加1次，每次2μL，边滴加边轻轻摇匀)至凝固，记录消耗凝血酶溶液体积，结果见表2。

结果表明，水蛭生品和炮制品中游离氨基酸为0.51%～0.77%，游离氨基酸含量较低，各样本之间的差异不大。水解氨基酸含量为24.7%～39.9%，各样本之间有一定的差异，水解氨基酸含量蚂蝗低于柳叶蚂蟥；经过醋炙、酒炙，含量基本略有下降；滑石粉炒含量基本不变；砂炒、蜜炙麦麸炒含量略有增加。蚂蟥和柳叶蚂蟥的抗凝血酶活性差异不大，但是高温炮制（砂炒、蜜炙麦麸炒、滑石粉炒）降低了柳叶蚂蟥的抗凝血酶活性。

图1 混合氨基酸对照品（A）、供试品中游离氨基酸（B）及水解氨基酸（C）HPLC图

表2 水蛭氨基酸及抗凝血酶测定结果 （n=2）

3 讨论

蚂蟥和柳叶蚂蟥，都为蚂蟥属Whimania动物，以食螺、蚌等软体动物为生，不吮吸动物血液。蚂蟥的游离氨基酸含量为0.64%，水解氨基酸含量为24.7%，柳叶蚂蟥的游离氨基酸含量为0.74%，水解氨基酸含量为37.5%，说明水蛭所含的游离氨基酸较少，而大部分是以蛋白质或多肽形式存在。两者的抗凝血酶活性相同，说明游离氨基酸和水解氨基酸的含量与抗凝血酶活性之间没有必然的量的关系，经过高温炮制的柳叶蚂蟥的抗凝血酶活性比生品降低了，推测水蛭中抗凝血酶活性物质可能是的体内存在的某种特定的小分子多肽类物质或者多肽类有效部位，这些物质遇热会发生降解或者变性，影响药效的发挥。

范尚坦等[5]研究表明，参照2010年版《中华人民共和国药典》（一部）收载用凝血酶滴定法测定水蛭药材中的含量，提取液的pH对测定结果产生非常大的影响，按药典方法得到的水蛭提取液的pH在3.0左右，会导致纤维蛋白原析出，无法证明水蛭有抗凝血酶活性，将提取液的pH调到5.0，水蛭的抗凝活性最佳，因此参考该文献在药典方法的基础上增加一步调节提取液pH到5.0，从而避免假阳性干扰，能真实评价水蛭的抗凝血酶活性。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：中国医药科技出版社，2010：77-78.

[2]程新法，喻 新.水蛭的综合研究近况[J].中医文献杂志，1997（3）：44-45.

[3]文洪宇，龙顺伯，罗 怡.水蛭炮制方法演变[J].中国药业，2009，18（20）：71-73.

[4]谢 谊，易 艳，刘 阳，等.柱前衍生HPLC测定阿胶中17种水解氨基酸含量[J].湖南中医药大学学报，2012，32（5）：46-49.

[5]范尚坦，李金兰，张 勇，等.水蛭中水蛭素含量测定的改进[J].中国中药杂志，2008，33（19）：2 277-2 279.