新辅助化疗对乳腺癌组织因子、基质金属蛋白酶-9和蛋白酶激活受体-2的表达及疗效的影响

北京大学第一医院乳腺疾病中心，北京 100034

新辅助化疗对乳腺癌组织因子、基质金属蛋白酶-9和蛋白酶激活受体-2的表达及疗效的影响

赵建新 林增茂 段学宁 刘荫华

北京大学第一医院乳腺疾病中心，北京 100034

背景与目的：组织因子(tissue factor，TF)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)是影响乳腺癌转移和预后的重要因子，蛋白酶激活受体-2(proteinase activated receptor-2，PAR-2)是二者之间的介导因子。本研究旨在探讨乳腺癌组织中TF、PAR-2和MMP-9表达的变化与乳腺癌新辅助化疗疗效的关系。方法：应用二步法免疫组织化学方法检测85例乳腺癌新辅助化疗前后乳腺癌组织中TF、PAR-2和MMP-9的表达，分析新辅助化疗前后其表达的变化与新辅助化疗疗效的关系。结果：85例乳腺癌新辅助化疗患者病理完全缓解率(G5)为8.3%，其他患者在新辅助化疗后TF、PAR-2和MMP-9阳性率均降低，其中MMP-9显著降低(P＜0.05)。新辅助化疗后，MMP-9表达阳性减弱的患者病理疗效显著好于阳性增强者(P＜0.05)；TF、MMP-9由阳性转为阴性患者的病理疗效显著好于由阴性转为阳性患者(P＜0.05)。PAR-2的改变则与病理疗效无显著关系。结论：乳腺癌新辅助化疗后TF、MMP-9的阳性表达降低与病理缓解率相关，有助于判断新辅助化疗疗效。

乳腺癌；组织因子；蛋白酶激活受体-2；基质金属蛋白酶-9；新辅助化疗

新辅助化疗是乳腺癌全身治疗的重要组成部分，新辅助化疗前后细胞因子的变化可能对患者的治疗和预后产生影响。组织因子(tissue factor，TF)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)是影响乳腺癌转移和预后的重要因子，蛋白酶激活受体-2(proteinase activated receptor-2，PAR-2)是二者之间的介导因子。因此，本研究旨在探讨乳腺癌组织中TF、PAR-2和MMP-9的表达变化与乳腺癌新辅助化疗疗效的关系。

1 材料和方法

1.1 研究对象

2008年1月1日—12月31日北京大学第一医院普通外科收治的经空心针穿刺活检病理诊断为乳腺癌的85例行新辅助化疗患者，年龄29～71岁，临床TNM分期：Ⅱ期59例，Ⅲ期26例，化疗方案为TE：多西他赛75 mg/m2，表柔比星75 mg/m2，每3周1次，化疗2～4个周期后手术，术后标本由同1位病理医师阅片。术前病理分型：浸润性导管癌(非特殊型)79例，其他类型6例(浸润性小叶癌4例，浸润性筛状癌1例，黏液癌1例)。组织学分级：1级23例，2级28例，3级34例。所有标本经4%甲醛溶液固定，石蜡包埋，连续切片，片厚4 μm。

1.2 TF、PAR-2和MMP-9蛋白检测方法及结果判定

1.2.1 主要试剂

第一抗体：小鼠抗人TF单克隆抗体购自Abcam公司(1:100)，小鼠抗人MMP-9单克隆抗体和小鼠抗人PAR-2单克隆抗体均购自Santa Cruz公司。第二抗体：辣根酶标记山羊抗小鼠IgG 购自北京中杉金桥生物技术公司，PV9000免疫组化二步法试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司。

1.2.2 免疫组化染色

标本经4%甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋，连续切片，切片厚度为4 μm，60 ℃烤片7 h以上后行免疫组化染色。

采用二步法检测TF、PAR-2和MMP-9蛋白的表达，按照试剂盒说明书操作。二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，微波抗原修复，依次用第一抗体(TF一抗1:100、PAR-2一抗1:100、MMP-9一抗1:200)和第二抗体温育，PBS洗片后DAB染色，Mayer氏苏木素复染后封片。正常人肝脏组织(TF高表达)和正常人心肌组织(PAR-2、MMP-9高表达)为阳性对照，PBS替代第一抗体作为阴性对照。

1.2.3 结果判定

阳性评判标准参照文献［1-2］的方法：每例观察10个高倍镜视野，连续计数不少于1 000个细胞，以肿瘤细胞的细胞质(MMP-9)或细胞膜(TF和PAR-2)呈现棕黄色为阳性；阳性细胞数＜10%为阴性，≥10%为阳性，按照阳性细胞数的多少量化为1+(10%)，2+(30%)，3+(70%)。化疗后阳性细胞数减少(或增多)称阳性减弱(或阳性增强)，即量变，其中由阳性转为阴性或由阴性转为阳性为质变。

1.3 新辅助化疗病理疗效评价

患者在新辅助化疗后接受全乳房切除术或保乳术，病灶组织根据病理(Miller-Payne系统)进行疗效评价［3］。1级(G1)：个别癌细胞有变化，但总数未减少；2级(G2)：＜30%癌细胞退变；3级(G3)：30%～90%的癌细胞退变；4级(G4)：＞90%的癌细胞退变；5级(G5)：未见浸润癌细胞，可出现导管原位癌。G1和G2为未显效，G3和G4为有效，G5为达到病理完全缓解。

1.4 统计学处理

采用SPSS 13.0软件进行数据分析，通过χ2检验判断化疗前后TF、PAR-2和MMP-9的表达变化及其与化疗疗效的关系，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 病理疗效

85例患者新辅助化疗后，病理疗效评价为G1为15例(17.6%)，G2为15例(17.6%)，G3为14例(16.5%)，G4为34例(40.0%)，G5为7例(8.3%)。未显效(G1+G2)占35.29%，有效(G3+G4)占56.47%。

2.2 G5组患者的新辅助化疗前TF、PAR-2和MMP-9蛋白表达情况

因G5病理完全缓解的标本无法进行肿瘤细胞的免疫组化染色，因此将这部分患者化疗前免疫组化染色结果进行归纳(表1)。

2.3 新辅助化疗前后TF、PAR-2和MMP-9蛋白表达情况变化

新辅助化疗前后TF、PAR-2和MMP-9阳性率均降低(图1～3)，其中MMP-9表达减少具有统计学意义(P＜0.05)，3者的阳性表达量变和质变的情况见表2。

2.4 新辅助化疗前后TF、PAR-2和MMP-9的表达变化与化疗疗效的关系

新辅助化疗后MMP-9表达阳性减弱的患者病理疗效显著好于阳性增强者(P=0.04)；TF和MMP-9由阳性转为阴性的患者病理疗效显著好于由阴性转为阳性患者(P＜0.05)，PAR-2的变化与化疗疗效无关(表3～5)。

表 1 达到病理完全缓解患者资料Tab. 1 The data of the pCR patients

表 2 新辅助化疗前后TF、PAR-2和MMP-9蛋白表达变化Tab. 2 The change of TF, PAR-2 and MMP-9 expression pre and post neoadjuvant chemotherapy

图 1 乳腺癌新辅助治疗前后TF、PAR-2和MMP-9的表达情况Fig. 1 The expression of TF, PAR-2 and MMP-9 pre and post-chemotherapy (EnVision, ×400)

表 3 TF的表达与化疗疗效的关系Tab. 3 The relation between TF and chemotherapeutic response

表 4 PAR-2的表达与化疗疗效的关系Tab. 4 The relation between PAR-2 and chemotherapeutic response

表 5 MMP-9的表达与化疗疗效的关系Tab. 5 The relation between MMP-9 and chemotherapeutic response

3 讨 论

新辅助化疗已成为治疗局部晚期乳腺癌患者的方法之一，具有早期全身治疗、降低肿瘤分期、提高手术切除率和保乳率、术前体内药敏试验、选择个体化治疗等优点。新辅助化疗的疗效评估主要通过临床体检、影像学［4］和病理学检查完成，其中金标准是病理检查，免疫组化因子的变化在疗效评估中的作用尚不明确。

TF和MMP-9可能通过影响肿瘤的侵袭、转移和血管生成等对化疗的疗效产生影响。在乳腺癌组织中两者的阳性表达率可达40%以上［5］。Ueno等［6］研究表明，TF在乳腺癌中的表达可作为生存的独立预后因素，对评价乳腺癌患者的远处转移和复发提供有效的前瞻性价值。Giannelli等［7］研究发现，乳腺癌术后血清中MMP-9 的活性较术前显著降低。MMP-9活性水平可作为术后重要的随访资料，王新友等［8］的研究也发现，血清MMP-9的活性水平与新辅助化疗的疗效显著相关。汤坚强等［9］认为，在人白血病细胞中TF可通过PARs调控MMPs的表达，PAR-2可能是TF激活MMP-9分泌的重要介导因子。因此，新辅助化疗对三者的作用可能影响患者的预后和疗效评估。

本研究主要通过化疗后肿瘤细胞密度和数量减低来评价疗效，其中有7例患者达到G5，这些患者化疗前TF、MMP-9、PAR-2的表达没有显示有规律性。新辅助化疗不仅使得患者的肿瘤细胞数量和密度发生变化，也使得细胞的分子标志物的表达发生改变，其中，化疗后MMP-9阳性表达率显著降低，而TF、PAR-2的阳性表达也有所减少。这可能由于MMP-9是TF和PAR-2激活后的效应因子，因此表达的降低更明显。新辅助化疗后TF、PAR-2和MMP-9发生量变的患者占全部患者的40%，发生质变的患者占20%。蛋白表达的变化可能导致肿瘤对化疗药物耐药，从而影响疗效。研究结果还显示，新辅助化疗后MMP-9表达阳性减弱的患者疗效显著好于阳性增强者，TF和MMP-9由阳性转为阴性的患者疗效显著好于由阴性转为阳性患者，表明化疗后出现TF、MMP-9的表达减少可能预示疗效较好；而PAR-2表达与患者疗效无关，这可能与PAR-2的表达阳性率较高有关，且PAR-2为多种信号通路蛋白，可能被其他蛋白影响，因此敏感性不高。部分患者在新辅助化疗后TF、MMP-9表达由阴性转为阳性，且多为疗效较差患者，提示化疗可能诱导TF和MMP-9表达增强，也可能与化疗药物耐药有关。

因此，新辅助化疗可使TF、MMP-9和PAR-2的阳性表达下降，三者的变化将有助于判断新辅助化疗的疗效。

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The impact of neoadjuvant chemotherapy on the expression of tissue factor, protease activated receptor-2 and matrix metalloproteinase-9

ZHAO Jian-xin, LIN Zeng-mao, DUAN Xue-ning, LIU Yinhua (Breast Disease Centre, Peking University First Hospital, Beijing 100034, China)

ZHAO Jian-xin E-mail: zjxcn@yahoo.com.cn

Background and purpose: TF and MMP-9 are important factors for prognosis and metastasis of breast cancer, PAR-2 is the mediate factor of them, this study aimed to evaluate the change of expressions of TF PAR-2 and MMP-9 in breast cancer patients after neoadjuvant chemotherapy and their correlations with pathologic response. Methods: The expressions of TF, PAR-2 and MMP-9 in 85 breast cancer tissues were examined by immunohistochemical technique (SP) before and after neoadjuvant chemotherapy. Correlation analysis were made between the change of expressions and pathologic response. Results: The strictly pathologic completely response rate (G5) was 8.3% in 85 breast cancer patients after neoadjuvant chemotherapy. The decrease of expression of MMP-9 after neoadjuvant chemotherapy was statistically significant correlations with pathological response (P＜0.05). The expression changes of TF and MMP-9 from positive to negative was statistically significant correlated with tumor pathological response(P＜0.05). The expression change of PAR-2 showed rarely significant (P＞0.05). Conclusion: The decrease of expression of TF and MMP-9 after neoadjuvant chemotherapy have statistically significant correlations with pathological response, would be probably useful for estimating the effect of neoadjuvant chemotherapy.

Breast cancer; TF; PAR-2; MMP-9; Neoadjuvant chemotherapy

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.03.007

R737.9

：A

：1007-3639(2013)03-0195-05

2012-10-10

2013-02-24）

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赵建新 E-mail:zjxcn@yahoo.com.cn

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