miR-301在结肠癌细胞增殖和凋亡中的作用

南昌大学第二附属医院胃肠外科，江西 南昌 330006

miR-301在结肠癌细胞增殖和凋亡中的作用

张忠来 熊欢 张兵 朱培谦

南昌大学第二附属医院胃肠外科，江西 南昌 330006

背景与目的：miR-301在多种恶性肿瘤中表达上调，然而其在结肠癌中的表达及功能尚不清楚。本研究旨在检测微小RNA miR-301在结肠癌组织中的表达，并在体内外研究miR-301反义寡核苷酸技术(ASO)对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响。方法：运用荧光定量PCR定量分析120例结肠癌患者癌组织及对应癌旁组织中miR-301的表达；通过miR-301ASO降低结肠癌SW620细胞中miR-301的表达，采用MTT、克隆形成实验、流式细胞技术及体内实验观察miR-301ASO对SW620细胞产生的生物学效应。结果：在120例结肠癌患者中，63.33%(76/120)的结肠癌组织miR-301表达明显高于对应癌旁组织(P=0.00)；与对照组miR-301的表达量(0.50±0.07)相比，miR-301ASO组可以显著降低miR-301的表达(0.09±0.01，P=0.00)；MTT实验结果显示，转染miR-301 ASO组24、48、96 h SW620细胞的存活数量均明显低于对照组(P＜0.05)；克隆形成实验结果显示，miR-301ASO组克隆形成率(5.33%±0.74%)较对照组(33.33%±8.38%)显著降低(P=0.00)；体内研究进一步证实miR-301ASO可以抑制肿瘤细胞的增殖，从而导致肿瘤生长较对照组慢(P=0.01)，肿瘤的体积较对照组明显减小(P=0.01)；流式细胞仪检测显示，转染miR-301ASO组SW620细胞凋亡指数(15.68±1.46)较随机染转染ASO组(3.36±0.88)明显增高(P=0.02)；另外，降低miR-301的表达发现Bcl-2的mRNA和Bcl-2蛋白均明显下降(P=0.00，P=0.00)。结论：miR-301在结肠癌组织中表达上调，降低miR-301的表达可有效抑制结肠癌细胞生长、促进细胞凋亡。miR-301有可能成为结肠癌基因表达调控的新靶点。

miR-301；结肠癌；反义单核苷酸

微小RNA(microRNA，miRNA)是一种内源性的非编码小分子RNA，广泛分布于动植物细胞体内。研究发现，miRNA在恶性肿瘤细胞的发生、发展中发挥重要作用，其中包括调控细胞的增殖、分化和凋亡［1-2］。Shi等［3］报道miR-301在乳腺癌中过表达，抑制乳腺癌细胞miR-301的表达后，细胞增殖、侵袭及迁移能力明显减弱，说明miR-301在乳腺癌中发挥重要作用。Lee等［4］研究报道，胰腺癌细胞系和组织中miR-301高表达，且与胰腺癌的侵袭转移密切相关。另外，Jiang等［5］研究也发现，miR-301在肝癌组织中呈过表达。本实验采用TagMan MGB探针法检测miR-301在结肠癌组织中的表达情况, 同时利用反义寡核苷酸技术(antisense oligonucleotide，ASO)抑制miR-301在结肠癌细胞中的表达，分析miR-301对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

收集2006年1月—2011年1月南昌大学第二附属医院胃肠外科结肠癌及对应癌旁组织手术标本(n=120)。 所有标本均经病理学检查确诊，其中男性106例，女性14例，年龄32～69岁。所有患者术前均未接受放化疗。

1.2 主要试剂和仪器

结肠癌SW620细胞由本实验室保存；TaqMan miRNA分析试剂盒购自美国ABI公司；L-15培养基购自美国Gibco公司、胎牛血清购自美国Hyclone公司、脂质体LipfectamineTM2000购自美国Invitrogen公司；miR-301 ASO购自宝生物工程(大连)有限公司；Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自南京凯基公司；总蛋白提取试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；鼠抗人Bcl-2单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；实时荧光定量PCR分析仪购自美国ABI公司，流式细胞仪购自美国BD公司。

1.3 方法

1.3.1 实时荧光定量PCR检测miR-301的表达

采用TRIzol试剂提取结肠癌组织及对应癌旁照组织中总RNA，采用紫外分光光度计测定浓度，-80 ℃保存，运用miR-301检测试剂盒检测miR-301的表达。首先取2 μg总RNA为反应模板与3 μL逆转录酶相互混合，反应体系为20 μL，反应条件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。反应结束后，收集cDNA，将其稀释150倍，然后取1 μL稀释的cDNA与2 μL TaqMan引物相混合，20 μL反应体系：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，59 ℃ 60 s，40个循环。相对miRNA表达采用ct值精确计算，将U6 snRNA作为内参。

1.3.2 反义miR-301单核苷酸序列设计

MiRBase提供的miRNA基因序列获取人miR-301的序列，并设计其反义寡核苷酸序列，同时运用核酸序列数据库检索程序以排除其他的同源序列。另外，同时设计一条随机对照序列，如下所示：miR-301顺义链：5’-AGUCACUAGUGGUUCCGUUUA-3’，反义miR-301 反义链：5’-TAAACGGAACCA CTAGTGACT-3’，随机序列顺义链：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反义链：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’，送Invitrogen公司合成，PAGE纯化，全硫代修饰。

1.3.3 细胞培养和ASO转染

将SW620结肠癌细胞接种于L-15培养基(含10%胎牛血清)，37 ℃、CO2体积分数为5%的条件下培养。严格遵照LipfectamineTM2000转染试剂盒操作程序进行转染，miR-301 ASO终浓度分别为：50、100、150、200 nmol/L，本实验组前期初步筛选出最佳终干扰浓度为100 nmol/L。转染后培养时间分别为24、48、72 h，初步筛出最佳作用时间为48 h。将荧光素(FITC)标记的硫代磷酸ASO转染后放置于倒置荧光显微镜下进行观察，上述操作重复3次。转染效率(不同视野镜下观察发光的细胞和总的细胞比)为88.5%±6.4%(图1)。

图 1 转染荧光素标记的硫代磷酸反义寡核苷酸效果图Fig. 1 The figure of transfection effect

1.3.4 转染miR-301 ASO后对miR-301表达的影响

转染miR-301 ASO与随机ASO 48 h后，提取总RNA，测定浓度，逆转录为cDNA(反应条件同1.3.1)，测定cDNA浓度。运用miR-301检测试剂盒检测miR-301的表达(反应条件同1.3.1)。上述操作重复3次。

1.3.5 克隆形成实验检测SW620细胞的增殖

结肠癌SW620细胞经转染后，取对数生长期的细胞，用3%胰蛋白酶消化细胞。接种于6孔培养皿中，大约500～600个细胞/孔，置于37 ℃、CO2体积分数为5%、饱和湿度的条件下，培养2～3周。观察细胞生长情况，当培养皿中出现肉眼可见的克隆细胞团时，终止培养。移去上清液，运用PBS漂洗2次。加4%甲醛溶液固定20 min，去除固定液，加适量Giemsa应用染色液染30 min，用ddH2O清洗染色液，经干燥后在显微镜下计数＞50个细胞的克隆数，克隆形成率＝克隆数/接种细胞数×100%。上述操作重复3次。

1.3.6 MTT检测SW620细胞增殖情况

收集SW620细胞，将各组细胞悬液在离心管内反复充分打匀，接种于96孔培养板(6×103/孔)，24 h后换液。实验分组同1.2.4，每组设有6个复孔。转染后1～4 d每孔加入MTT试剂(浓度为5 mg/mL)20 μL，在37 ℃、CO2体积分数为5%的条件下继续温育4 h。用移液器吸取各孔上清，每孔加入DMSO 150 μL，在室温条件下摇10 min(置水平摇床)以充分完全溶解MTT结晶。测定各孔490 nm处的吸光度(A)值。每组重复3次。按下列公式计算细胞生长抑制率(%)：细胞生长抑制率＝(A490实验组平均值-A490对照组平均值)/A490对照组平均值×100%。上述操作重复3次。

1.3.7 活体内检测miR-301 ASO对SW620细胞增殖的影响

将18只(4～5周龄)裸鼠(上海斯莱克公司)饲养于SPF无菌环境下。在SW620细胞转染miR-301 ASO或随机ASO后，取对数期生长的细胞(约2×106个)制成150 μL细胞悬液，运用微量注射器接种于裸鼠左侧大腿背部皮下。成瘤后定期测量肿瘤的体积，并运用公式V=D×d2×π/6(D、d分别代表肿瘤的最大直径和最小直径)计算肿瘤的体积［6］，绘制肿瘤生长曲线。饲养6周后处死裸鼠，取瘤称重。经4%甲醛溶液固定、石蜡包埋、HE染色后，在光镜下观察肿瘤组织的病理学特征。

1.3.8 流式细胞术分析细胞早期凋亡

实验分组同1.2.4，将细胞接种于6孔板中，转染miR-301 ASO。经48 h后收集细胞并制备为单细胞悬液，采用PBS漂洗2次，离心、弃上清液。最后运用Annexin Ⅴ-FITC早期凋亡试剂盒和流式细胞仪检测各组细胞的早期凋亡情况。上述操作重复3次。

1.3.9 检测各组细胞Bcl-2 mRNA的表达水平

各组培养细胞加入TRIzol裂解液，提取总RNA，逆转录为cDNA，运用SYBR Green Realtime PCR Master Mix通过荧光定量PCR方法检测Bcl-2的mRNA表达。Bcl-2的引物序列为上游：5’-AACTGGGG GAGGATTGTGGC-3’；下游：5’-GATCCAGGTGTGCAGGTGCC-3’。反应条件：95 ℃变性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。以GAPDH作为内参。在ABI7500反应平台上进行PCR反应。

1.3.10 检测各组细胞Bcl-2蛋白的表达水平

收集转染miR-301 ASO的SW620细胞，运用总蛋白提取试剂盒提取总蛋白，经10%SDSPAGE电泳后转膜，将膜放在含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液中37 ℃封闭2 h，加一抗稀释液1∶500稀释鼠抗人Bcl-2单克隆抗体在4 ℃温育过夜，每次用TBST缓冲液洗膜10 min，共3次，加辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG(1∶1 000稀释)，置于37 ℃温育2 h，每次用BST缓冲液洗膜10 min，共3次，运用ECL化学发光法检测目的蛋白条带。以β-actin作为内参。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 结肠癌组织miR-301的表达情况

利用实时荧光定量PCR检测120例结肠癌患者癌及对应癌旁组织miR-301的表达，结果发现：63.33%(76/120)例患者结肠癌组织miR-301的表达明显高于对应癌旁组织，差异有统计学意义(P＜0.05，图2)，其余36.67%(44/120)例患者结肠癌组织miR-301的表达与对应癌旁组织相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.2 降低miR-301的表达对SW620细胞存活率的影响

通过荧光定量PCR方法检测发现，转染miR-301 ASO组，miR-301的相对表达量(0.09±0.01)较对照组(0.50±0.07)明显降低(P=0.00，图3A)。同时MTT检查结果发现，转染miR-301 ASO组细胞生长较对照组明显降低，其24、48、96 h的细胞生长抑制率分别为53.57%、59.13%和70.08%，差异均有统计学意义(P＜0.05，图3B)。

2.3 降低miR-301的表达对体外SW620细胞增殖的影响

克隆形成实验结果提示，转染miR-301 ASO组SW620细胞克隆形成率5.33%±0.74%，较对照组33.33%±8.38%明显降低(P=0.00，图4)。

图 2 实时荧光定量PCR检测120例结肠癌患者癌及对应癌旁组织miR-301表达的盒须图Fig. 2 The box-plot of miR-301 expression level in 120 groups of colon cancer and adjacent normal tissues using quantitative PCR

图 3 转染miR-301 ASO后SW620细胞miR-301的表达和生长情况变化Fig. 3 The expression of miR-301 and the growth of SW620 after transfection of miR-301 ASO

图 4 转染miR-301 ASO后SW620细胞克隆形成率明显降低Fig. 4 The colony formation rate of SW620 cell was significantly reduced after transfection of miR-301 ASO

2.4 降低miR-301的表达对活体肿瘤增殖的影响

本实验所有的裸鼠肿瘤成瘤率为100%，实验结果发现，转染miR-301ASO组的肿瘤生长较对照组明显缓慢，差异有统计学意义(P=0.01，图5)。

2.5 降低miR-301的表达对SW620细胞凋亡的影响

结肠癌细胞SW620转染miR-301 ASO后，流式细胞仪检测细胞凋亡的结果显示，转染miR-301 ASO组SW620细胞凋亡指数为15.68±1.46，较随机转染ASO组3.36±0.88明显增高(P=0.02，图6)。

图 5 活体内miR-301ASO转染的SW620细胞所形成肿瘤的体积变化Fig. 5 Tumor growth curves after transfection of miR-301 ASO

2.6 降低miR-301的表达对Bcl-2 mRNA和Bcl-2蛋白表达的影响

miR-301 ASO转染SW620细胞后，利用荧光定量PCR和Western blot检测各组细胞中Bcl-2 mRNA和Bcl-2蛋白表达水平，结果发现转染miR-301 ASO组Bcl-2 mRNA(1.05±0.04)和Bcl-2蛋白(0.21±0.03)的相对表达水平明显低于随机转染ASO组(4.87±0.96，0.88±0.09)，差异均有统计学意义(P=0.00，图7)。

图 6 流式细胞仪检测miR-301 ASO转染后的SW620细胞凋亡情况Fig. 6 Apoptosis in SW620 cells after transfection of miR-301 ASO

图 7 Bcl-2 mRNA和蛋白在转染miR-301 ASO 的SW620细胞中的表达情况Fig. 7 Bcl-2mRNA and protein level in SW620 cell after transfection of miR-301 ASO

3 讨 论

结肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，尤其常见于西方发达国家，在中国结肠癌发病率的增长速度是全球平均增长水平的2倍［12］。在确诊为结肠癌患者中，约50%以上属于临床晚期，治疗效果不理想。因此，急需寻找新的肿瘤标志物来进一步提高结肠癌的早期诊疗效果。miRNAs是一类新的基因调控因子，在控制细胞的生长、分化、血管形成及凋亡等过程中发挥着非常重要的作用［7-8］。随着越来越多的miRNA被发现和深入研究，证实miRNAs与恶性肿瘤密切相关，大约有调控miRNAs编码基因位的52%位于肿瘤相关染色体区域［9-10］。另外，研究认为miRNA可以作为癌基因或者抑癌基因在肿瘤的发生、发展中起作用。因此，miRNAs可能成为诊断肿瘤新的分子标志和判断肿瘤治疗及预后的分子靶点。miRNAs在转录后水平调节靶基因的表达，更有助于恶性肿瘤的早期发现、早期诊断和早期治疗，其必将具有广阔的临床应用前景［11］。

本实验首先在检测发现，miR-301在结肠癌组织中表达上调，与miR-301在乳腺癌及胰腺癌的表达明显上调相符［3-4］，表明miR-301在结肠癌发生发展中可能发挥重要作用。ASO是一类经人工合成或构建的反义表达载体表达的寡核苷酸片段，长度多为15～30个核苷酸，通过碱基互补原理，干扰基因的解旋、复制、转录、mRNA的剪接加工乃至输出和翻译等各个环节。为了进一步分析miR-301对结肠癌细胞功能的影响，本实验通过转染miR-301 ASO降低结肠癌细胞SW620中miR-301的表达，同时利用MTT方法检测降低miR-301的表达后SW620细胞生长情况，结果发现转染miR-301 ASO的SW620细胞存活率明显降低。此外我们运用克隆形成实验，观察到转染miR-301 ASO后，SW620细胞克隆形成率比随机ASO组明显减少。同时本实验在活体内实验进一步证实转染miR-301 ASO组SW620细胞皮下形成肿瘤的体积较随机ASO组显著减小，差异有统计学意义(P＜0.05)。表明miR-301在结肠癌细胞的生长中起着非常重要的作用。

为了分析降低miR-301表达对结肠癌细胞凋亡情况的影响，本实验运用流式细胞技术检测SW620细胞凋亡情况，结果发现转染miR-301 ASO组细胞凋亡指数较随即转染ASO组明显增高(15.68±1.46 vs 3.36±0.88)。众所周知，Bcl-2与细胞凋亡的关系密切。为证实miR-301与Bcl-2有关联，本实验检测了各组Bcl-2 mRNA和Bcl-2蛋白表达水平，结果发现，转染miR-301 ASO组Bcl-2 mRNA和Bcl-2蛋白表达水平明显低于随机转染ASO组。表明miR-301可能通过调节Bcl-2的表达影响细胞的凋亡，从而进一步达到对肿瘤细胞增殖能力的调控。

综上所述，miR-301在调控结肠癌细胞的增殖和凋亡方面发挥重要作用，很可能成为诊断结肠癌新的分子标志物，为结肠癌临床基因治疗提供新的靶点。但其具体的作用机制，如miR-301如何调控结肠癌细胞的增殖及miR-301如何调控Bcl-2而影响细胞凋亡的问题还有待于进一步深入研究。

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The role of miR-301 in colon cancer cell proliferation and apoptosis

ZHANG Zhong-lai, XIONG Huan, ZHANG Bing, ZHU Pei-qian (Gastrointestinal Surgery, the Second Affiliated Hospital of Nanchang University Nanchang, Nanchang Jiangxi 330006, China)

ZHU Pei-qian E-mail: zhupeiqian@163.com

Background and purpose: The miR-224 in a variety of malignant tumors is overexpression, however, its expression and function in colon cancer are not clear. The aim of this study was to investigate the expression of miR-301 in colon cancer tissues and demonstrate the regulative effects of miR-301 ASO on the proliferation and apoptosis of colon cancer cell in vitro and in vitro. Methods: The expression of miR-301 in 120 colon cancer tissues and their adjacent tissues was detected by real-time quantitative PCR method. After transfection with miR-301ASO, the biological effects of miR-301 in SW620 cells were measured by MTT assay, the colony formation experiment, flow cytometry and the in vivo experiment. Results: The expression level of miR-301 was found to be overexpressed in 63.33% (76/120) of the colon cancer cases (P＜0.05). miR-301 expression in SW620 cells (transfection with miR-301 ASO, 0.09±0.01) was significantly less than control group (0.50±0.07, P=0.00). MTT assay results showed that SW620 cells survived rate at 24, 48 and 96 h decreased greatly after transfection with miR-301ASO (P=0.00). Clone formation assay revealed that miR-301 ASO group colony formation rate (5.33%±0.74%) was significantly lower than the control group (33.33%±8.38%, P=0.00). In vivo study further confirmed that miR-301ASO could inhibit the proliferation of SW620 cells (P＜0.05), and miR-301ASO group grew substantially slow compared with the negative control group (P=0.00). Flow cytometry indicated that the apoptotic index in miR-301 ASO group (15.68±1.46) was significantly higher than the control group (3.36±0.88, P=0.02). In addition, the Bcl2 mRNAand protein were significantly decreased after reduce the expression of miR-301 (P=0.00, P=0.00). Conclusion: MiR-301 was overexpressed in human colon cancer. Reduce the expression of miR-301 can effectively inhibit the growth of colon cancer cells and promote apoptosis. MiR-301 may become a new target for the regulation of gene expression in colon cancer.

MiR-301; Colon cancer; Antisense oligonucleotides

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.06.006

R735.3+5

：A

：1007-3639(2013)06-0432-07

2013-02-25

2013-05-13）

朱培谦 E-mail:zhupeiqian@163.com