注射用盐酸头孢替安无菌检查方法

高锡来

【摘 要】本文对各规格注射用盐酸头孢替安的无菌检查方法进行了论述，介绍其试验过程及注意事项。

【关键词】无菌检查法、注射剂、盐酸头孢替安

【中图分类号】R978.1【文献标识码】A【文章编号】1672-5158（2013）02-0330-01

（1） 供试品溶液制备：

规格2.0g取供试品20支，每支分别加0.9%无菌氯化钠溶液6ml使溶解，再分别吸出3ml转移至500ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，摇匀，制成约40mg/ml的供试溶液；

规格1.0g取供试品20支，每支分别加适量0.9%无菌氯化钠溶液使溶解后，全部转移至500ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，摇匀，制成约40mg/ml的供试溶液；

规格0.5g取供试品20支，每支分别加适量0.9%无菌氯化钠溶液使溶解后，全部转移至500ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，摇匀，制成约20mg/ml的供试溶液；

规格0.25g 取供试品30支，每支分别加适量0.9%无菌氯化钠溶液使溶解后，全部转移至500ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，摇匀，制成约15mg/ ml的供试溶液；

（2）薄膜过滤：

将上述制备好的供试品溶液置3个滤筒中同时过滤，每筒过滤供试液约170ml；以加入青霉素酶的0.9%无菌氯化钠溶液为冲洗液，总冲洗量1000 ml（预先加入青霉素酶1支，2ml/支，酶活力不低于300万单位/ ml），分次冲洗，即单筒冲洗量约300ml，加酶不低于200万单位/筒；以大肠埃希菌为阳性对照菌，依法检查（《中国药典》2010年版二部附录XI H），应符合规定。

验证用具：

1 供试品

注射用盐酸头孢替安2.0g（批号B201012302、B201012304 、B201012306）

2 培养基

由北京陆桥技术有限责任公司及奥博星生物技术有限责任公司提供

1 硫乙醇酸盐流体培养基 批号：100925

2 改良马丁培养基 批号：100611

3 营养肉汤培养基 批号：091010

4 玫瑰红钠琼脂培养基 批号：20100405

5 营养琼脂培养基 批号：20100306

验证试验用菌种名称及其编号：由中检所提供

1 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B） 26003]；

2 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]；

3 大肠埃希菌（Escherichia coli） [CMCC（B）44102]；

4 生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC（B）64941]；

5 白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]；

6 黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]。

青霉素酶（2 ml/支，酶活力不低于300万单位/ml）

验证步骤：

1.1 菌液的制备

（1）接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，于30～35℃培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，于23～28℃培养24～48小时；分别取上述培养物1ml，加至9ml 0. 9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-7、10-7、10-5、10-6，10-5，制成每1ml含菌数小于100cfu/ml的菌悬液，混匀备用。

（2）取经23～28℃培养5-7天的黑曲霉改良马丁琼脂斜面培养物，加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液将孢子洗脱，然后，用管底部有一圆孔并带有薄的无菌棉花的无菌试管滤出孢子悬液至无菌空试管中，再用上述0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu孢子悬液，混匀备用。

（3）菌液计数：分别取上述细菌菌液和真菌菌液1m加入培养皿，每种菌液做平行2皿，注入相应琼脂培养基15～20ml。细菌30～35℃培养48小时；真菌23～28℃培养72小时。

（4）判断标准

每1ml菌液中含菌数小于100cfu。

（5）计数结果：见无菌检查法验证试验记录表1。

2.2 产品验证

（1）供试品溶液制备：

1）供试品溶液制备：取供试品20支，每支分别加0.9%无菌氯化钠溶液6ml使溶解，再分别吸出3ml转移（1/2量转移）至500ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，制成约20mg/ml的供试溶液，摇匀备用。

（2）方法验证：

2）试验组：取一全封闭集菌培养器（三筒），将上述其中1份供试液按薄膜过滤法置3个滤筒中过滤（每筒过滤供试液约170ml，含供试品约6. 6g）。供试液过滤后，用总量1000ml的0.9%无菌氯化钠溶液（预先加入青霉素酶1支，2 ml/支，酶活力不低于300万单位/ ml）同时冲洗三个滤筒，单筒冲洗量约300 ml，分次冲洗，每次100ml，每次过滤前应充分振摇。冲洗液过滤后，三筒均注入硫乙醇酸盐流体培养基100ml，其中一筒不加菌液，作为本次试验的供试品对照，供试品对照应无菌生长；另外两筒，一筒加入上述1.1中制备好的大肠埃希菌试验菌液1ml，一筒加入金黄色葡萄球菌试验菌液1ml，同法操作，共做3组，6种试验菌及相应培养基逐一进行验证，将所有培养基筒置规定条件下培养观察。

3）对照组：另取一全封闭集菌培养器，不过滤供试品和冲洗液，直接注入硫乙醇酸盐流体培养基100ml，并加入上述1.1中制备好的大肠埃希菌试验菌液1 ml，作为对照。同法操作，6种试验菌及相应培养基逐一进行验证，将所有培养基筒置规定条件下培养观察。

4）阴性对照组：另取一全封闭集菌培养器，各过滤冲洗用0.9%无菌氯化钠溶液300ml后，再分别加入硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基各100ml，置规定条件下培养观察。

5）培养：硫乙醇酸盐流体培养基筒30-35℃培养3天；改良马丁培养基筒23-28℃培养5天，每天观察并记录结果。

6）试验结果：见无菌检查法验证试验记录表2。

3 结果判断

该品种按上述方法进行验证试验，各对照管培养48～72小时均生长良好；与对照管比较，含供试品各容器中的试验菌均生长良好；供试品对照管及阴性对照管培养5天，均无菌生长。试验结果表明：该供试品在此检验量和检验条件下抑菌作用可忽略不计，故可照此方法进行该品种的无菌检查，根据中国药典2010年版附录XIH的相关规定及各试验菌生长情况，阳性对照菌为大肠埃希菌。

4 结论

注射用盐酸头孢替安（2.0g）无菌检查法：采用薄膜过滤法，取供试品20支，每支分别加0.9%无菌氯化钠溶液6ml使溶解，再分别吸出3ml转移（1/2量转移）至500ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，摇匀，制成约40mg/ml的供试液；将上述供试液置3个滤筒中同时过滤，每筒过滤供试液约170ml；供试液过滤后，用总量1000 ml的0.9%无菌氯化钠平均冲洗3个滤筒，并预先在冲洗液中加入1支青霉素酶（2 ml/支，酶活力不低于300万单位/ ml），分次冲洗，即单筒冲洗量不少于300ml/筒，加酶不低于200万单位/筒；阳性对照菌为大肠埃希菌；其他操作依据中国药典2010年版。