紫杉醇脂质体的制备及其表征＊

王 薇 ，许 鑫 ，2，胡 戴 ，2，匡长春 ，李 欧 ，2，符旭东

(1.中国人民解放军广州军区武汉总医院药剂科，湖北 武汉 430070;2.湖北中医药大学，湖北 武汉 430065)

紫杉醇(paclitaxel，PTX)是从红豆杉属植物中提取出来的一种高效抗肿瘤活性的天然物质，具有促进微管蛋白聚合、抑制解聚、抑制细胞有丝分裂的作用[1－2]，临床主要用于卵巢癌和乳腺癌的治疗。目前临床上使用较多的是紫杉醇注射剂，但注射剂中的溶剂无水乙醇和聚氧乙烯蓖麻油易引起过敏反应，且由于缺乏靶向性，副作用较大[3]。因此，紫杉醇脂质体靶向制剂成为了研究热点。本课题组拟研究具有主动靶向功能的长循环脂质体，在他人研究的基础上，对紫杉醇脂质体的处方和工艺进行了优化，研制出了包封率高、粒径较小、稳定性好的紫杉醇脂质体，以期为后续研究奠定基础。现将紫杉醇脂质体的制备、含量测定方法和特性表征报道如下。

1 仪器与试药

BP211D型电子天平(SARTOTIUS，Amerca);Anke TGL－16G－A型高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂);RE－52A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);KT－300Y型超声波药品处理机;SHZ－Ⅲ型循环水真空泵(上海亚荣生化仪器厂);JY92－2D型超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技有限公司);Malvern Nano－ZS90激光粒度仪;JEM－2100(HR)透射电子显微镜;Agilent 1100型高效液相色谱仪;透析袋(8000－14000，BIOSHARP);SHZ－82型恒温振荡器(常州国华电器有限公司)。紫杉醇(武汉远城科技发展有限公司，批号为1007001，纯度99.7%);大豆卵磷脂(Sigma);胆固醇(上海伯奥生物科技有限公司);其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 脂质体制备

精密称取处方量的胆固醇0.5 g、大豆卵磷脂0.5 g、紫杉醇0.01 g，充分溶解于氯仿中，置250 mL的圆底烧瓶中，将烧瓶置旋转蒸发仪中，于40℃水浴下减压旋转45 min，以彻底挥去有机溶剂，用含5% －乳糖的pH=7.4磷酸盐缓冲液(PBS)10 mL水化，探针超声6 min后分别过0.45和0.22 μm的聚碳酸脂膜各3次，即得紫杉醇脂质体溶液。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱:依利特 C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇 －水 －乙腈(23∶41∶36);检测波长:227 nm;流速:1.0 mL/min;柱温:25 ℃;进样量:20 μL。

2.2.2 溶液制备

取异丙醇/无水乙醇/无水乙醚[4]，按体积比为2∶2∶1，混合均匀，作为破乳剂。精密称取紫杉醇5.0 mg，置10 mL容量瓶中，加适量破乳剂溶解，稀释至刻度，摇匀，得对照品贮备液。精密量取该贮备液2 mL，置10 mL容量瓶中，加破乳剂稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液(紫杉醇质量浓度为100 μg/mL)。精密量取1 mL脂质体，置10 mL容量瓶中，加适量破乳剂溶解，稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液过0.45 μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性试验:取2.2.2项下的紫杉醇对照品溶液，按上述色谱条件注入液相色谱仪;另取处方量辅料，置10 mL容量瓶中，按拟订方法制备空白对照溶液，注入液相色谱仪，分别记录高效液相色谱图(图1)，考察系统适用性。结果表明，在该色谱条件下，辅料对紫杉醇的测定无干扰。

线性关系考察:分别精密移取2.2.2项下对照品贮备液0.02，0.1，0.2，0.5，1，2，3，5 mL，置 10 mL 容量瓶中，加入破乳剂定容至刻度，摇匀，分别注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定色谱峰面积，以峰面积(A)为纵坐标、质量浓度(C)为横坐标进行线性回归，得回归方程 A=3 933.9 C －919.06，r2=1(n=8)。结果表明，紫杉醇质量浓度在1～250 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

图1 高效液相色谱图

精密度试验:取同一对照品溶液，重复进样6次，按拟订色谱条件测定色谱峰面积。结果 RSD=1.01%，表明方法精密度良好。

稳定性试验:分别取2.2.2项下对照品溶液和供试品溶液，分别于放置 0，3，6，12，24，48 h时注入液相色谱仪，记录峰面积。在上述时间点处的峰面积分别为392 206，392 470，393 450，395 208，394 119，393 417，溶液中紫杉醇的 RSD 为 0.28%，表明对照品溶液和供试品溶液均在48 h内稳定性良好，能满足测量需要。

加样回收试验:精密量取脂质体1 mL，置10 mL容量瓶中，分别加入 0.6，0.45，0.33 mL 对照品贮备液，用破乳剂定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液过0.45 μm微孔滤膜，即得。每份平行操作2次，分别取20 μL注入液相色谱，以峰面积按外标一点法计算回收率。结果见表1。

2.3 紫杉醇脂质体表征考察

2.3.1 粒径分布和电荷

取制备好的紫杉醇脂质体，适当稀释后，用Malvern Nano－ZS90激光粒度仪进行测定，平均粒径在54.6 nm左右，电位－40.9 mV。

2.3.2 形貌观察

取制备好的紫杉醇脂质体，适当稀释后，滴加在有支持膜的专用铜网上，用3%的磷钨酸钠溶液染色后，自然晾干后在透射电镜下观察脂质体形态，见图2。可见，脂质体的形态呈圆形或类圆形。

表1 加样回收试验结果(n=9)

图2 紫杉醇脂质体的外观形态

2.3.3 包封率及载药量测定

按照2010年版《中国药典(二部)》中的相关规定，脂质体包封率=系统中包封药量/系统中包封与未包封总药量×100%。脂质体载药量=药量/脂质体重量×100%。

包封率测定:取1 mL制备好的脂质体溶液，加入3 mL破乳剂后水浴超声15 min，充分破乳后取20 μL进高效液相色谱检测紫杉醇的含量，得到脂质体溶液中总的紫杉醇含量;另取1 mL脂质体溶液，在15 000 r/min离心15 min后取上清液[5]，加入3 mL破乳剂后水浴超声15 min，充分破乳后取20 μL进高效液相色谱检测紫杉醇的含量，得到脂质体溶液中被包载的紫杉醇含量。测得试验制备的紫杉醇脂质体的包封率为(97.95±1.32)%，RSD=1.35%(n=8)。

载药量测定:将制备好的脂质体溶液采用低温冷冻干燥的方法冻干得到冻干粉，称取少量的干粉，加入破乳剂/水(3/1，V/V)的混合溶液后水浴超声15 min，充分破乳后取20 μL进高效液相色谱检测紫杉醇的含量;另配置紫杉醇的对照品溶液。计算得紫杉醇脂质体的载药量，试验测得该脂质体的载药量约为2.48%(n=4)。

2.3.4 体外释放度测定

取紫杉醇脂质体溶液2.0 mL，加入透析袋(截留分子量为8 000－14 000)内，两端夹紧后置20 mL的30%乙醇溶液中，于37℃恒温摇床中以100 r/min的速度持续震摇。紫杉醇注射液溶为阳性对照。分别在 0，0.25，0.5，1，2，4，6，8，12，24 h 取出1 mL透析液，同时补充相同体积的释放介质，48 h时取出全部的脂质体溶液，直接破乳计算出紫杉醇的量。采用高效液相色谱测定，计算紫杉醇的释放百分率。释放百分率 F%=At/Ao×100%。其中 F为累积释放度，At为累积释放紫杉醇的量，Ao为加入透析袋中紫杉醇的总量。

2.3.5 稳定性考察

图3 紫杉醇注射液和脂质体的体外释药曲线

将制备好的脂质体分别于4℃和室温(20～25℃)放置，定时观察脂质体溶液的外观变化并测定包封率。结果表明，在4℃条件下放置 0，1，2，3，4 周，包封率分别为 97.77% ，94.49% ，93.72% ，86.84% ，82.35%;室温下放置 0，1，2，4，6 d，包封率分别为 98.76% ，92.33% ，81.27% ，63.91% ，58.78% ，且脂质体溶液发生浑浊，有絮状物出现。由此可见，脂质体溶液应在4℃保存。

3 讨论

本试验采用薄膜分散法制备脂质体，紫杉醇的最终质量浓度为1 g/L，制备的脂质体粒径较小，稳定性好，在4℃条件下存放1个月亦没有药物析出。体外释放结果显示紫杉醇注射液的释放曲线符合零级动力学模式(r2=0.992 1)，而脂质体溶液的体外释放曲线符合Higuchi方程(r2=0.991 1)，与紫杉醇注射液相比，脂质体具有明显的缓释效果。

迄今脂质体的制备工艺已较成熟，脂质体给药前的粒径成为该制剂应用的较大障碍，如何制备出粒径较小的脂质体及选择合适的冻干保护剂和冻干技术，使脂质体冻干粉在复溶时粒径改变最少，且同时保持脂质体原有的特性，是脂质体类药物必须解决的难题。同时，粒径较大的脂质体容易被网状内皮系统(RES)吞噬，靶向到肝肾等部位，而长循环脂质体通过将亲水性大分子如聚乙二醇(PEG)等镶嵌到脂质体表面，能降低血液成分(主要是网状内皮系统的血浆调理素)对脂质体的识别，以降低脂质体的血液清除率，延长脂质体在血浆中的稳定时间，提高药物的生物利用度[6－7]。本实验室制备的紫杉醇脂质体粒径较小、稳定性好，为后期的长循环脂质体的制备奠定了基础。

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