绵羊c-Myc的克隆与序列分析

王子竹，安铁洙，李昊，朴善花，王春生

（东北林业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨150040）

绵羊c-Myc的克隆与序列分析

王子竹，安铁洙，李昊，朴善花，王春生

（东北林业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨150040）

参照GenBank上绵羊c-Myc序列设计引物，利用RT-PCR技术从60d左右胎羊生殖嵴总RNA中扩增得到绵羊c-Myc基因编码区序列，其为包括终止密码子在内的1320 bp，编码有439个氨基酸。同源性分析结果显示，绵羊c-Myc基因编码区与牛、猪、猫、人、大鼠、小鼠、鸡、爪蟾和斑马鱼的核苷酸序列同源性分别为98.0%、94.1%、92.4%、90.4%、86.9%、86.2%、75.2%、66.4%和63.9%，其氨基酸序列同源性分别为98.0%、94.0%、92.5%、90.3%、87.2%、86.5%、72.2%、65.5%和64.6%；生物信息学软件分析显示，绵羊c-Myc含有细胞核定位模体和HLH结构域。本研究为进一步研究c-Myc基因的功能及探讨其中绵羊体细胞重编程中的作用奠定了基础。

绵羊；c-Myc；序列分析

自Takahashi[1]等（2006）首次利用Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4等转录因子诱导小鼠成纤维细胞为多能干细胞（induction pluripotent stem cells,iPS细胞）以来，采用上述相同或相近的方法，已相继诱导大鼠、猴、人、猪、兔等体细胞获得iPS[2-7]。上述结果显示，c-Myc在诱导哺乳动物体细胞为iPS过程中发挥重要作用。目前，与其他动物的c-Myc因子相比，尚未见到有关绵羊c-Myc的相关报道。本研究利用胎羊生殖嵴组织提取总RNA，并扩增获得绵羊c-Myc基因编码区序列，在此基础上，与其他物种的c-Myc比较并预测了其所表达的蛋白特点，为进一步探明绵羊c-Myc基因的功能和建立完善的绵羊iPS方法提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、载体及菌株

rTaq DNA聚合酶、BamHI、HindIII、T4连接酶、Oligo15引物、pMD18-T载体及反转录试剂盒（TAKARA）；Trizol（Invitrogen）；质粒小提小量试剂盒和胶回收试剂盒（Omega）；Trans5α感受态细胞（TransGen）。

1.2 胎绵羊生殖嵴总RNA提取

选择性成熟的东北半细毛羊进行自然交配，在母羊怀孕后的第60 d，处死并采集子宫内的胎儿。采集胎羊生殖嵴组织50 mg，采用Trizol法提取总RNA，并置于-80℃冰箱保存。

1.3 引物设计及合成

根据GenBank中绵羊的c-Myc基因mRNA序列，利用primer5.0设计一对引物，扩增包括编码区在内约1 400 bp序列。引物由宝生物公司合成，序列如下：

1.4 cDNA的获得

在含有1 μg总RNA和1 μL Oligo15（50 μM）的0.2 mL的EP管中，添加3 uL DEPC灭菌水，在70℃下保持10 min后冰浴2 min，再依次加入5x M-MLV Buffer 2 μL、dNTP（10 mM）0.5 μL、RNase Inhibitor 0.25 μL、RTase M-MLV 0.5 μL和DEPC灭菌水0.75 μL，置于42°C保持1 h，70°C保温15 min，冰浴数分钟，以获得cDNA。

1.5 c-Myc基因编码区的克隆与测序

以上述cDNA为模板，以Sc-Myc-1和Sc-Myc-2为引物对Klf4基因进行PCR扩增。PCR反应体系25 μL，其中cDNA 1μL，dNTP（2.5 mM）4 μL，rTaq Buffer（10x）2.5 μL，引物Sc-Myc-1和Sc-Myc-2各1 μL，rTaq酶0.3 μL。PCR反应条件为：94°C预变性5 min，94°C变性30 s，58°C退火45 s，72°C延伸45 min，30个循环，结束循环后72°C再延伸7 min。

PCR产物经过电泳回收后，与pMD18-T载体室温连接5 min（PCR回收产物7.5 μL，pMD-18载体1 μL，T4连接酶0.5 μL，T4 buffer 1 μL），取5 μL连接产物转化50 μL Trans5α型感受态细胞，Amp抗性及蓝白斑筛选。挑取白色克隆于含有Amp的LB培养基中摇菌，小提小量试剂盒提取质粒。

以Sc-Myc-1和Sc-Myc-2为引物对重组质粒进行PCR鉴定；用BamHI和HindIII对重组质粒进行酶切鉴定。取PCR及酶切鉴定均正确的c-Myc-pMD18重组质粒送Invitrogen公司测序。

1.6 生物信息学分析

用NCBI blastn程序和DNAMAN软件分别进行核苷酸和推导的氨基酸序列比对，在NCBI站点上利用ORF finder分析软件识别开放阅读框(ORF)。采用DNAMAN5.2软件比对高同源蛋白的氨基酸序列并构建进化树。利用PlantsP(http://plantsp.genomics.purdue.edu/html/)和ScanProsite软件(http://us.expasy.org/ prosite/)分析蛋白功能结构域。用Psort软件(http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/)分析c-Myc蛋白的亚细胞定位。查找推测的氨基酸序列是否具有锌指结构序列。

2 结果

2.1 绵羊c-Myc基因编码区的RT-PCR扩增

利用Sc-Myc-1和Sc-Myc-2引物对获得的胎绵羊生殖嵴组织cDNA进行RT-PCR扩增，并经1%琼脂糖凝胶电泳，其结果在紫外灯下可见约1 400 bp的目的条带(图1)。

将上述RT-PCR扩增产物连接到pMD18-T载体上，获得重组质粒c-Myc-pMD18。将重组质粒用BamHI和HindIII双酶切，获得与预期结果一致的约为1 400 bp和小于3000 bp的两个片段(见图2)。并且，以重组质粒c-Myc-pMD18为模板，用PCR方法对其进行扩增，可得到一条约为1400 bp的核酸片段，显示目的基因已克隆到pMD18-T载体中(如图3)。

图1 RT-PCR结果

图2 c-Myc-pMD18质粒PCR鉴定结果

图3 c-Myc-pMD18质粒双酶切鉴定结果

2.2 c-Myc基因编码区核苷酸序列及氨基酸序列分析

将c-Myc-pMD18重组质粒进行测序后，经生物软件分析表明绵羊c-Myc基因编码区序列为包括终止密码子在内的1320bp，编码419个氨基酸。

利用BioEdit软件将绵羊c-Myc序列与GenBank中牛c-Myc的参照序列（NM_001046074）进行比对，其结果，其同源性为98.0%，二者存在27处差异。c-Myc基因编码区序列同牛、猪、猫、人、大鼠、小鼠、鸡、爪蟾和斑马鱼的核苷酸序列同源性分别为98.0%、94.1%、92.4%、90.4%、86.9%、86.2%、75.2%、66.4%和63.9%，见图4。

图4 绵羊与各物种c-Myc核苷酸序列序列同源性分析

利用DNAStar软件绘制不同物种c-Myc编码区序列系统进化树，其结果，绵羊与牛亲缘关系最近，遗传距离最小；而与猪、猫、人、大鼠、小鼠、鸡、爪蟾和斑马鱼亲缘关系依次变远，与传统分类学基本相符，见图5。

图5 十个物种c-Myc编码区核苷酸序列构建的分子系统发育进化树

将绵羊c-Myc蛋白与从Genbank上下载的鼠、牛和猪等物种的c-Myc蛋白进行比对。其结果表明绵羊c-Myc蛋白同牛、猪、猫、人、大鼠、小鼠、鸡、爪蟾和斑马鱼的c-Myc氨基酸的同源性分别为98.0%、94.0%、92.5%、90.3%、87.2%、86.5%、72.2%、65.5%和64.6%，见图6。

图6 绵羊与各物种c-Myc氨基酸序列同源性分析

2.3 绵羊c-Myc蛋白的结构预测和功能域分析

利用PSORT Prediction（http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/）对推测的氨基酸序列进行蛋白质亚细胞定位进行了分析，其结果，c-Myc定位在细胞核的概率为94.1%，表明最有可能定位在细胞核内，见图7。

图7 绵羊c-Myc蛋白质功能域预测

根据c-Myc氨基酸序列的查询，绵羊c-Myc编码的蛋白含有在354-406位氨基酸（DKRRThNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPElENNEKAPKVVIL KKATAYILSVQ）含有一个HLH特异结构域（图7）。

3 讨论

已有大量的研究证实，c-myc在诱导哺乳动物体细胞为iPS过程中发挥重要作用。据Yano等[8]（1993）报道，c-Myc基因既是一种致癌基因，又是一种转录因子，其在正常细胞生长和增殖过程发挥作用，但是，如果c-Myc基因过高表达可往往诱发人类癌症疾病。此外，现已证实[9]，c-Myc基因中存在有调控细胞周期的关键区域，通过该区域的调节细胞增殖生长或细胞凋亡。上述结果表明，c-Myc可能与其他相关诱导因子发挥协同作用，通过其调控细胞周期的关键区域，阻止细胞进入细胞周期，从而发挥抑制细胞分化的功能。

与其他动物相比，有关绵羊iPS诱导因子的相关研究相对滞后，仅有极少的绵羊Klf4基因[10]和Sox2基因[11]的相关文献，且尚未见有利用绵羊内源性诱导因子诱导绵羊iPS获得成功的报道。为了建立完善的绵羊iPS诱导方法及其机制，本研究在克隆获得绵羊c-Myc基因的编码序列的基础上对其序列进行了分析。其结果，绵羊c-Myc基因编码区序列，其为包括终止密码子在内的1320bp，编码有439个氨基酸，与牛、猪、猫、人、大鼠、小鼠、鸡、爪蟾和斑马鱼等物种c-Myc基因具有63.9%以上的同源性，其中与牛同源性最为接近，达98.0%（图4）。与此同时，绵羊c-Myc蛋白氨基酸序列与上述各种动物的同源性达到64.6%以上，其同样与牛c-Myc蛋白的具有最高同源性，达到98.0%（图6）。分子进化树分析也表明，绵羊与牛亲缘关系最近，遗传距离最小；而与猪、猫、人、大鼠等亲缘关系依次变远，与传统分类学基本相符（参见图5）。上述结果表明，已成功克隆获得绵羊c-Myc基因的编码序列，能否利用其建立完善的绵羊iPS方法有待于进一步探讨。

据Berns等[12]的研究表明，c-Myc基因由3个外显子及2个内含子组成，其中第一个外显子序列与动物不同具有较大的差异，且只具有调控作用，而第二和第三外显子为编码蛋白质序列且具有高度保守性。本研究序列比较结果显示，绵羊c-Myc基因具有相似的特性。迄今尚未见到有关绵羊c-Myc基因编码蛋白的相关报道。本研究对c-Myc基因的推测结果显示，c-Myc蛋白含有细胞核定位模体，在第354-406位氨基酸含有HLH结构（图7）。有关c-Myc蛋白在绵羊iPS诱导过程中作用机制有待于探讨。

[1]Takahashi K,Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J].Cell,2006,126(4):663-676.

[2]Takashi K,Tanabe K,Qhnuki M,et al.Induction of pluipotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factor[J].Cell,2007,（131）:1-12.

[3]Lui H,Zhu F,Yong J,et al.Generation of induced pluripotent stem cells from adult rhesus monkey fibroblasts[J].Cell stem cell,2008，(3):6587-6590.

[4]Liao J,Cui C,Chen S Y,et al.Generation of induced pluripotent stem cells lines from adult rat cells[J].Cell Stem Cell,2009，(4):11-15.

[5]Esteban M,Xu J,Yang J,et al.Generation of induced pluripotent stem cell lines from Tibetan miniature pig[J]. J Biol Chem,2009,284(26):17634-17640.

[6]Honda A,Hirose M,Hatori M,et al.Generation of induced pluripotent stem cells in rabbits-potential experimenyal modela for human regenerative medicine[J].J Biol Chem,2010,（285）:31362-31369.

[7]Bao L,He L,Chen J,et al.Reprogramming of ovine adult fibroblasts to pluripotency via drug inducible expression of defined factor[J].Cell Res,2011,（21）:600-608.

[8]Yano T.,Sander C.A.,Clark H.M.et al.Clustered mutations in the second exon of the Myc gene in sporadic Burkitt’s lymphoma[J].Oncogene,1993,8(10):2741-2748.

[9]Wade M,Wahl G.M.c-Myc,Genome Instability,and Tumorigenesis:The Devil Is in the Details[J].CTMI, 2006,（302）:169-203.

[10]王春生，杨越飞，宁方勇，等.绵羊Klf4基因逆转录病毒载体的构建与检测[J].中国兽医学报,2011，31 (8):1118-1122.

[11]赵健灵，安铁洙，张志人，等.绵羊Sox2基因逆转录病毒载体的构建与检测[J].中国畜牧兽医，2012,39 (5):217-220.

[12]Berns EM,Klijn JG,van Putten WL.c-myc amplification is a better prognostic factor than HER2/neu amplification in primary breast[J].Cancer Res,1992,52(5):1107-1113.

Cloning and Coding Sequence Analysis of Sheep c-Myc Gene

WANG Zhi-zhu,AN Tie-zhu,LI Hao,PIAO Shan-hua,WANG Chun-sheng
（College of Life Science,Northeast Forestry University,Harbin 150040,China）

The c-Myc gene was amplified from E60 sheep genital ridge mRNA,and ligated with linear vector pMD-18T.The sequencing results of sheep c-Myc gene(already been logged in GenBank,indicated that it's CDS,including stop coden,was in a length of 1320bp,encoding 439 amino acids,and contained nuclear localization motifs and HLH domain showed by bio-software analysisng.Sheep c-Myc gene also shared 98.0%、94.1%、92.4%、90.4%、86.9%、86.2%、75.2%、66.4%and 63.9%nucleotide homology and 98.0%、94.0%、92.5%、90.3%、87.2%、86.5%、72.2%、65.5%and 64.6%amino acid identity with Bos taurus,Sus scrofa,Felis catus,Homo sapiens,Rattus norvegicus,Mus musculus,Gallus gallus,Xenopus laevis and Danio rerio respectively.The successful cloning of c-Myc shows that the gene in the structure and function is very conservative and helpful to study gene function and role in somatic reprogramming in future.

sheep;c-Myc;sequence analysis.

S814.8

A

1003－6377（2013）01－0024-05

2012-11-27

国家自然科学基金资助项目（31000990）；中央高校基本科研业务费专项资金资助(DL10BA06)

王子竹（1987-），女，辽宁人，硕士研究生。

王春生（1979-），男，博士，副教授，研究方向：体细胞重编程。E-mail：wangchunsheng79@163.com