海南尖峰岭野生灵芝菌种培养基配方筛选*

陈 友 胡佳娟 陈勇敢

（1.琼州学院，海南 三亚 572022；2.三亚市第二中学，海南 三亚 572000）

海南尖峰岭野生灵芝菌种培养基配方筛选*

陈 友1胡佳娟2陈勇敢1

（1.琼州学院，海南 三亚 572022；2.三亚市第二中学，海南 三亚 572000）

以琼州学院灵芝栽培培养基配方为基础，对海南尖峰岭两种野生灵芝的一、二、三级菌种的培养基配方进行筛选试验结果，一级种较优培养基为PDA+1/4MS（马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、1/4MS培养液、20 mL的1/4MS培养基）；二级种的较优培养基为Y1005（木屑78％、麦麸或米糠20％、蔗糖1％、石膏1％，含水量50％～60％），三级种的较优培养基为Y3102（木屑73％、黄豆粉5％、麦麸20％、蔗糖1％、石膏1％，含水量60％～65％）。

海南；野生灵芝；培养基；配方；筛选

灵芝（Ganoderma lucidum）[1]素有“仙草”、“瑞草”之称，古今药理与临床研究均证明其有防病治病、延年益寿的功效。

灵芝属担子菌纲、多孔菌目、多孔菌科、灵芝属[2]，主要生长在雨林、山坡草地和海滨红树林中腐朽的树干、树根或木桩上[3]。我国地跨热带至寒温带，灵芝科种类多而分布广[2]，计有78种，分属4属、3亚属、2个组[4]，以海南岛分布种类最多，占全国灵芝科的53.6％[2]。

灵芝丰富的生物活性成分决定了其功能的多样性[5]。目前已分离到灵芝的150余种活性成分，有多糖类、核苷类、生物碱类、氨基酸、蛋白质类、三萜类和矿质元素[6]等。其中，灵芝多糖能提高机体免疫力、刺激干扰素的形成，同时能提高机体抗病毒、抗氧化、抗肿瘤[7]、耐缺氧等多方面的功能[8]，还能有效地促进肝脏、骨髓、血液中DNA 、RNA和蛋白质的合成，从而达到益寿延年的功效[9]；灵芝中所含有的纤维素可在大肠中脱水，能有效地防止便秘，还可降低胆固醇，预防动脉粥样硬化等；从灵芝粗脂肪中分离出的三萜类物质，具有止痛、镇静、解毒、保肝、抑制组织胺释放、毒杀肿瘤细胞等多种功效，而其药理药效对人体无任何副作用[10]。

野生灵芝品种的驯化研究是资源利用中不可或缺的一环。笔者选择海南尖峰岭不同原生境的两种野生灵芝作为材料，以琼州学院灵芝培养基配方为基础，优化一级、二级、三级菌种的培养基配方，用以培育优良菌种，供后期人工栽培。

1 材料与方法

1.1 试验材料 供试材料是两株生长于海南省尖峰岭地区不同原生境的野生灵芝。将黄边灵芝（Ganoderma luteomarhinatum）编号4-3，咖啡网孢芝（Humphreya coffeatum)编号4-5。

1.2 试验方法 培养基供试配方见表1。

（1）一级种（母种）培养。以配制100 mLPDA培养基为例说明。首先按配方称量各种原料的1/10，加水适量，加热后滤液，加水至100 mL。加琼脂煮溶，补水至100 mL的滤液置于250 mL锥形瓶内，于121 ℃下灭菌20 min。然后，将灭好菌的培养基分成9个平板，贴标签。其他3种培养基中1/2MS、1/4MS和1/10MS培养基是由标准MS培养基分别稀释至2倍、4倍和10倍后加入。

表1 灵芝一、二、三级菌种的培养基试验配方

过夜待平板内水分被培养基完全吸收后，分别接入两种灵芝菌种，每个菌种每种培养基接3个平板，并做好标记。用保鲜膜将平板封紧，背面以所接菌种为原点，画两条相互垂直的线，记作A、B，每两天记录一次各平板A、B线上菌丝圈的直径大小，累计7次，历时14天。通过数据的相关统计分析，确定两种灵芝各自最佳的生长配方。最后以最佳者为一级种接种到二级培养基上进行培养。

（2）二级种的培养。根据配方配制所需培养基。以Y1004为例，首先按比例称取各原料并搅拌均匀，边搅拌边加水，含水量约60％，以手用力抓料，指缝中无水滴出但松手后手掌湿润为宜。培养料装瓶（15瓶）后，贴上标签，将料瓶及其他用具于121 ℃下灭菌120 min后，及时转移至接种室，待温度降至室温后进行接种并在标签纸上注明所接菌种的编号及接种日期。

将培养瓶置于25 ℃下培养并适时记录菌丝的生长高度。满瓶后，分别以时间、高度、长势为依据计算、分析、比较各灵芝菌株在不同培养基上的生长速度，取最佳者作为二级种接种到三级培养基上。

（3）三级种的培养。三级种采用栽培袋培养，试验步骤与二级种基本相同。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对灵芝一级种菌丝生长的影响由表2、图1可知，灵芝4-3号的一级种菌丝在培养基PDA+1/4MS上的生长速度较快，长势较好；而灵芝4-5号菌丝在培养基PDA+1/2MS和PDA+1/4MS上生长快，长势好。综合4-3号和4-5号的一级种生长情况，认为PDA+1/4MS培养基为一级种的较优培养基配方。

2.2 不同培养基对灵芝二级种菌丝生长的影响由表2可知，灵芝4-3、4-5的二级种在培养基Y1005上菌丝生长速度快，密度大，为两个菌种的二级种最佳培养基配方。所以，均以Y1005培养基上的菌落作为菌种接种到三级种培养基上。

2.3 不同培养基对灵芝三级种菌丝生长的影响由表2、图2可知，灵芝4-3、4-5的三级种的菌丝均在培养基Y3102上生长速度快，且菌丝浓密，长势良好；在培养基Y3101上菌丝前期长势良好，但后期生长停滞并出现明显的黄化现象。

表2 灵芝一、二、三级种在不同培养基上菌丝生长情况

3 讨 论

图1 不同培养基中灵芝一级种菌丝生长状况

图2 不同培养基中灵芝二级种菌丝生长情况

3.1 试验中较适母种培养基配方是以PDA培养基配方为基础，加入MS母液进行梯度筛选，结果灵芝4-3号、4-5号的一级种在培养基PDA+1/4MS上的生长速度及长势均很好。此配方既适合栽培种也适合野生种，可作为一级种培育的首选配方。试验中灵芝4-5号在培养基PDA+1/2MS上也具有较佳生长速度，这说明野生灵芝不同品种的一级种配方还存在进一步优化的空间。

3.2 两个野生灵芝菌株二级种在Y1005培养基上均具有较佳长势。4种培养基配方均以木屑为主料，试验结果差异主要在于辅料。所有的植物组织培养基都需要有碳水化合物作为能源，蔗糖作为组织培养的碳源则具有普遍性和广泛性。两个菌株在Y1005麦麸培养基中菌丝生长速度快、菌丝浓密，而在Y1004玉米粉培养基中菌丝长速较慢、长势较差。分析原因是麦麸颗粒较松散，培养料内氧气量充足，较适宜菌丝生长；而玉米粉颗粒间空隙小，菌种培养过程放置时间长易吐黄水，不利于菌丝生长。Y1005、Y1006的差异还在于Ca2+的存在形式，试验表明石膏中的Ca2+较过磷酸钙更利于灵芝吸收，且更经济，更具有可取性。

3.3 研究表明，主料中添加麦麸等含氮量高的辅料会明显提高灵芝产量，添加量为20％时产量较高[11]。两个灵芝菌株三级种在Y3102黄豆粉培养基上较Y3101玉米粉培养基生长速度快，菌丝浓密，这主要与黄豆粉较松散，利于菌丝生长有关。

参考文献

[1] 赵继鼎.中国灵芝科的分类研究Ⅺ.灵芝亚属灵芝组[J].真菌学报, 1989, 8(1): 25-34.

[2] 贾定文,郑林用. 灵芝属真菌分类研究现状及分析[J].西南农业学报,2003,16:64.

[3] 叶向花,杨勇岐. 灵芝栽培新技术[J].现代农业科技2007,16:46.

[4] 吴兴亮. 中国海南岛灵芝资源及其分布特征 [J]. 菌物系统, 1998, 17(2)：

[5] YUE Qing-Xi,GUAN Shu-hong et. Interaction of Ganoderma Triterpenes with Docetaxel and Cisplatin in Cytotoxicity against Human Carcinoma Cells[J]. Chinese Journal of Natural Medicines,2008,6(5):367-371.

[6] R.Saltarelli et. Food Chemistry[J].contents lists available at Science Direct Food Chemistry ,2009: 143-151.

[7] Xiao-Ling Zhu, Alex-F. Chen, Zhi-Bin Lin. Ganoderma lucidum polysaccharides enhance the function of immunological effector cells in immunosuppressed mice [J].Journal of Ethnopharmacology, 2007 (111) :219–226.

[8] 毛健，马海乐. 灵芝多糖的研究进展[J].食品科学，2010, 31(1): 295-299.

[9] 丰永红,于淑娟. 一种生理活性物质灵芝多糖[J].武汉工业学院学报,2002,19(3):19-21.

[10] 刘存芳. 灵芝营养成分综述[J]. 南江科技, 2008(5):20, 122-129.

农业部热带种质资源保护项目《香蕉种质资源调查与收集》（12RZZY-47）；琼州学院青年教师科研基金项目《海南野生香蕉驯化研究》（No.QY200917）；三亚市院校专项资金项目《海南野生灵芝驯化研究》（No.YD09041）。

陈友(1975-)，男，讲师，主要从事香蕉种质资源多样性及遗传关系研究，E-mail:342389998@qq.com。