仓鼠经口给予亚砷酸盐后血浆中砷结合蛋白的纯化

王文文，张 敏，李春辉，秦颖洁，那仁满都拉

(1.承德医学院病理及病理生理教研室，河北 承德 067000;2.承德医学院附属医院，河北 承德 067000;3.浙江大学药理毒理与生化药学研究所，浙江 杭州 310058)

砷是公认的致癌物，人们长期接触砷可能会导致皮肤癌、肝癌、肺癌和膀胱癌。在世界范围内，部分人因长期饮用被砷污染的水而患上各种疾病。然而，对砷的毒性机制目前尚未完全明了。一般情况下，砷在动物体内通过一系列酶介导的甲基化反应进行生物转化，产生甲基化的三价和五价代谢产物，最终以五价的单甲基和/或二甲基砷化合物随尿液排出体外［1-2］。许多研究指出，砷中间代谢产物如单甲基亚砷酸(MMAⅢ)和二甲基亚砷酸(DMAⅢ)与蛋白质的半胱氨酸残基有高度亲和性［3-4］。而且多种砷结合蛋白在体内或体外被鉴定，包括大鼠血红蛋白、金属硫蛋白、硫氧还蛋白过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽过氧化物酶［5-8］。实验结果显示，三价砷化合物的细胞毒性及遗传毒性比相对应的氧化形态即五价砷化合物更强。近期研究表明，砷与蛋白的相互作用可能是砷产生毒性或致癌的一个重要分子机制［9-11］，三价砷化合物与蛋白的结合可能改变了蛋白的结构和活性［12］。

砷结合蛋白可在暴露于不同的砷化合物的动物血浆中(如大鼠和仓鼠)检测到，尤其是慢性暴露后大鼠血浆中含量更为丰富。张等［13］在尿毒症患者血浆中检测到一种砷结合蛋白并鉴定为转铁蛋白。我们在亚砷酸处理后的大鼠血浆中，成功分离出主要的砷结合蛋白形态，并鉴定为二甲基亚砷酸-血红蛋白-结合珠蛋白(DMAⅢ-Hb-Hp)三联体复合物，这种复合物与人体内的砷结合蛋白不同［14］。

本研究为了更好地阐明砷与蛋白的结合，采用仓鼠经口给予 0.5 mg三价亚砷酸(iAsⅢ)，然后应用3种不同的HPLC色谱柱即分子筛色谱柱、凝胶过滤柱和阴离子交换柱结合电感耦合等离子质谱仪(ICP MS)纯化仓鼠血浆中的砷结合蛋白。结果发现，三步骤纯化方法可快速分离血浆中砷结合蛋白。

1 材料和方法

1.1 试剂 盐酸氨基丁三醇、氨基丁三醇和1，3-二氨基丙烷购买于 Sigma(St.Louis，MO，USA);30%过氧化氢、氯化氢、醋酸铵、醋酸、28%氨水溶液、亚砷酸钠和二甲基砷酸购于和光纯药(大阪，日本);单甲基砷酸(MMAV)从三化学品(山梨，日本)获得。ICP-MS的砷标准 液 购 于 SPEX CentiPrep(Metuchen，NJ，USA)。砷化合物的储备液(10 mol)从各自标准化合物中提取制备，储放在阴暗4℃处。标准液的稀释液在每次使用前配制。

1.2 HPLC-ICP-MS分析 HPLC系统由 PU-610液相色谱仪溶剂输送泵和DG660B-2脱气器(GL Sciences Co.，Tokyo，Japan)组成。GS-220 HQ和Protein KW-8037 G色谱柱(排阻范围分别为3 kD和170 kD)用于分离低分子和高分子成分(GS-220 HQ和Protein KW-8037 G，色谱柱)。将 20 μl或 200 μl的等量样品注入色谱柱，分别用50 mmol/L乙酸铵缓冲液或50 mmol/L Tris-HNO3缓冲液(pH 7.4，25℃)以0.6 ml/min的流速进行冲洗。阴离子交换柱 ES-520N7C(Shodex Asahipak)用 20～200 mmol/L的1，3-二氨基丙烷缓冲液 (pH 9.0，25℃)，以1.0 ml/min 的速度冲洗，用100 μl等量样本溶液加入柱中。安捷伦HP7500 ICP MS(Yokogawa Analytical Systems，Hachiouji，Japan)联合1.0 ml/min D2气体流的八极反应体系监测冲洗的亚砷酸，防止40Ar和35Cl+(信号在m/z 77)的分子干涉。

1.3 动物实验 动物实验均遵循“动物实验原则”(NIH版，1996年修订本)，并在浙江大学中国动物调查委员会的指导下进行。7周龄雄性仓鼠，在以12 h为明暗周期，室内温度保持在22℃ ～25℃饲养，自由饮食。1周适应期后，将体重为110～150 g的仓鼠分配到实验组(n=3)。用蒸馏水配制质量浓度为0.5 mg/ml砷的亚砷酸溶液，以每公斤体重0.5 mg砷给予8周龄仓鼠口服，分别于1、3、5 d后将仓鼠处死。对照组(n=3)给予与实验组等量的蒸馏水，其它实验条件与实验组相同。

1.4 用凝胶过滤和阴离子交换柱层析方法纯化亚砷酸结合蛋白 基于紫外检测器在280 nm处的吸光度检测蛋白(Shimadzu，Kyoto，Japan)。第一步，将仓鼠血浆内 As-BP以0.6 ml/min的速率用Tris-HNO3缓冲液从凝胶过滤KW柱洗脱，收集保留时间为13～15 min。第二步，将凝胶过滤柱得到的馏分用 Amicon Ultra-15(Millipore，10 kD)脱盐和浓缩，用ES520阴离子交换柱以1，3-二氨基丙烷线性浓度梯度洗脱分离蛋白(pH 9.0)。接着，将最初的5 min调整为用浓盐酸1，3-二氨基丙烷(pH 9.0，温度25℃)洗脱，15 min内用线性浓度梯度的0%缓冲液 A到100%缓冲液 B［200 mmol/L 的 1，3-二氨基丙烷(pH 9.0，温度25℃)］，再用100%缓冲液B洗脱15 min(流速1.0 ml/min)。收集保留时间为16～18 min，砷结合蛋白片段通过Amicon Ultra-15离心过滤装置浓缩并脱盐。第三步，浓缩片段再次加入到KW-803色谱柱里洗脱。

1.5 SDS-PAGE分析 在不同分离过程中收集到的每个蛋白样本(1 μg蛋白/样本)通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)分离，即先将蛋白样本用4.75%浓缩胶浓缩，然后经10%～15%分离胶按分子量大小进行分离。蛋白条带通过银染色检测，扫描和脱色后，进行胰蛋白酶消化。

1.6 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析 电泳结束后考马斯亮蓝染色，目的蛋白的回收采用电洗脱，用刀片切取胶上差异蛋白点，放入Eppendorf管，进行胶内酶解，Trypsin冰上吸胀45 min，37℃酶解16 h，水溶液(35%、65%、100% 乙腈，0.1%TFA)超声3次，真空冷冻浓缩至10 μl，取样品进行点靶上样。通过 NCBI蛋白质序列数据库(http://www.matrixscience.com)进行检索。

2 结果

2.1 单次经口给予三价砷后仓鼠血浆中砷分布与时间依赖关系 利用凝胶过滤柱GS220柱测定了仓鼠血浆中的砷结合蛋白，追踪1 d至5 d仓鼠血浆内的砷结合蛋白。经口给予亚砷酸(iAsⅢ)后第1天，可清楚地检测到砷结合蛋白(保留时间9.2 min);给药后第3天，砷结合蛋白明显减少接近于对照组(图1)，这表明在仓鼠血液中结合蛋白质的砷可能从砷结合蛋白中游离了出来。

图1 单次经口给予三价砷后仓鼠血浆中砷分布与时间的关系Fig.1 Time-related changes in the distribution of arsenic in hamster plasma after a single oral administration of iAsⅢ

2.2 HPLC-ICP-MS联用KW-803色谱柱鉴定仓鼠血浆中的砷结合蛋白 本实验通过HPLC-ICP-MS技术与KW-803色谱柱联用测定了仓鼠血浆中的砷结合蛋白，砷结合蛋白分子量大约为40～50 kD(图2A)。为了阐明砷结合蛋白中砷的化合物类型，收集了保留时间在15～18 min的砷结合蛋白样本，加热变性后用H2O2氧化，用离子交换柱ES-502N分离检测。结果发现从蛋白分离出来的砷形态主要以MMAV存在，其次是DMAV和少量的iAsV。这表明这些砷化合物被H2O2氧化前主要以三价还原形态存在(图2B)。

图2 HPLC-ICP-MS联用KW-803色谱柱确定仓鼠血浆中的砷结合蛋白Fig.2 Arsenic-binding proteins in hamster plasma determined on a KW-803 column by HPLC-ICP MS

2.3 借助HPLC-ICP-MS技术，利用凝胶过滤柱和离子交换柱分离纯化仓鼠血浆中的砷结合蛋白 本实验选择经口给予亚砷酸后第1天的仓鼠血浆作为整个实验的血浆来源。为了鉴定血浆中的砷结合蛋白，本实验利用2种不同的色谱柱凝胶过滤柱KW-803和离子交换柱ES-502N，结合三步法纯化血浆中的砷结合蛋白。首先，用KW-803柱收集保留时间在15～18 min的砷结合蛋白馏分(图3A)，在280 nm处紫外吸收检测洗脱的蛋白(虚线);其次，利用离子交换柱用1，3-二氨基丙烷浓度梯度将这些收集的砷结合蛋白样品进一步分离，紫外吸收度显示，砷结合蛋白可从其他杂蛋白例如非砷结合蛋白等(assenic unbound proteins)中分离出来(图3B)。然后在此基础上，将ES-520色谱柱保留时间为19～21 min的砷结合蛋白馏分用KW-803色谱柱分离(图3C)。每一个步骤所得的馏分样品进行蛋白定量，用于SDS-PAGE分析。

图3 通过凝胶过滤和阴离子交换柱联用HPLC-ICP-MS技术纯化仓鼠血浆中砷结合蛋白Fig.3 Arsenic-binding protein in hamster plasma purified by three steps on gel filtration and anion exchange columns by HPLC-ICP MS

2.4 SDS-PAGE凝胶电泳分析由 HPLC-ICP-MS系统凝胶过滤柱和离子交换柱获得的每个蛋白片段 每一步纯化的馏分用SDS-PAGE(10%聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析，图4示随着纯化步骤的进行，蛋白条带显著增加，并检测到相应分子量为47 kD，与色谱法结果一致。提示结合IC-PMS可以有效的追踪砷，凝胶过滤柱和阴离子交换柱对于快速纯化砷结合蛋白很有帮助。

图4 SDS-PAGE分析凝胶过滤和阴离子交换柱联用HPLC-ICP-MS技术所得蛋白Fig.4 SDS-PAGE profile ofeach protein fraction obtained on gel filtration and anion exchange columns by HPLC-ICP MS

3 讨论

近年研究表明，砷中毒诱导的癌症通常与长期暴露于iAsⅢ有关，砷的中间代谢产物如MMAⅢ和DMAⅢ参与和介导了砷的毒性及致癌过程［15-18］。

Kala等［19］报道，大鼠暴露于 iAsⅢ后通过ESI-MS技术能准确地鉴定出大鼠胆汁中砷化合物的形态，并发现，在胆汁中砷化合物以三价与谷胱甘肽共轭体形式存在，表明三价砷化合物对半胱氨酸残基有高度亲和性。体外和体内实验支持三价砷化合物有很高的蛋白亲和性，其可抑制硫氧还蛋白还原酶、硫氧还蛋白过氧化物酶和丙酮酸脱氢酶［7-9］等一些关键酶，三价砷化合物和这些蛋白的巯基相互作用是发挥毒性的一个可能机制［9，14］。事实上，许多研究者已利用在不同的细胞系上砷亲和树脂，如苯砷-琼脂糖(PAO-琼脂糖)鉴定特定的砷结合蛋白。然而，涉及到砷处理的细胞或组织中直接分离砷结合蛋白的研究信息很少。因此，有必要发展更加简单快速的方法分离砷处理样本中的砷结合蛋白。

有研究表明，仓鼠体内砷的分布和排泄与人类更相似，而且这两种物种比大鼠更容易受到砷的危害［2，20］。本研究发现，仓鼠在 iAsⅢ中暴露的第1天，就能在血浆中检测到砷结合蛋白，第3天显著下降(图1)。为分离仓鼠血浆中的砷结合蛋白，本实验采用2种不同的HPLC色谱柱，体积排阻柱和阴离子交换柱(图2)，根据洗脱结果，仓鼠血浆中的砷结合蛋白分子量约为40～50 kD。在此基础上，本研究利用IC-PMS追踪砷，并对砷结合蛋白保留时间结合2种相对应的柱子进行蛋白质组分分馏(图3A-C)。另外，本研究借助浓度梯度方法，对砷结合蛋白馏分样品进行了分离，发现随着1，3-二氨基丙烷的浓度的增加，砷结合蛋白可以从其它杂蛋白中分离出来，但砷的峰高明显比体积排阻柱得到的砷结合蛋白峰值低。

介于仓鼠血浆中砷结合蛋白与大鼠血浆中砷结合蛋白形态不同，本研究通过MALDI-MS技术多次对所获得的片段进行鉴定，但最终未得到确切的砷结合蛋白。

4 结论

尽管我们前期研究成功的分离大鼠血浆中的砷结合蛋白，并且通过MALDI MS确定大鼠血浆中的砷结合蛋白为DMAⅢ-Hb-Hp复合物，但是仓鼠血浆中砷结合蛋白似乎与大鼠血浆中不同。因此，本研究利用了2种不同的HPLC色谱柱，凝胶过滤柱和阴离子交换柱，结合电感耦合等离子质谱仪纯化了仓鼠经口给三价砷后的血浆中的砷结合蛋白，表明这种方法是分离纯化动物血浆或组织上清砷结合蛋白简便快速的方法。

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