增殖性细胞核抗原、C－fos和Bax蛋白在人胚胎舌组织中的表达

刘学红，张 泳

(绍兴文理学院医学院组织与胚胎学教研室，浙江 绍兴 312000)

胚胎时期，舌组织的分化发育受到各种基因的调控。蛋白是基因的外在表达产物，相应蛋白在组织细胞的表达分布规律能反映基因的活动规律。增殖细胞核抗原(proliferating nuclear antigen，PCNA)是一种在增殖细胞中合成或表达的核内多肽，是目前能较好反映细胞增殖状况的一个指标［1］。C-fos属于myc癌基因家族，编码产物为核内转录因子，参与细胞生长、增殖、分化和信息传递等活动［2］。Bax是Bcl-2家族的一员，参与细胞线粒体凋亡途径，其阳性表达程度反映细胞的凋亡状况［3－4］。目前关于PCNA、C-fos和Bax蛋白在动物和人消化系统组织中的分布及病理作用机制研究较多［3－6］，但关于这3种蛋白在人胚胎舌组织发育过程中的表达、分布规律及作用机制国内外未见文献报道。本研究通过观察人胚胎舌组织生长发育过程中3种蛋白的表达、分布规律，探讨三者在舌组织分化、发育过程中的作用，为临床先天畸形和口腔疾患的研究提供正常的形态结构基础和理论依据。

1 材料和方法

1.1 胚胎收集 收集因意外原因造成人工流产、发育正常的人胚胎标本共16例(采集标本均获得产妇本人同意)。根据产妇末次月经、B超所测胎儿双顶径和人胚胎形态学特征等确定胎龄为7～16周。以每4周为1个月龄组，每月龄为一研究组，其例数分布如下:第2个月龄5例，第3个月龄6例，第4个月龄5例。

1.2 标本制备 从胎尸内取出舌标本，用4℃生理盐水冲洗舌组织，分别取舌体、舌尖和舌根组织各1块，放入10%的中性甲醛水溶液中固定12 h后，取出流水冲洗30 min，行常规脱水、透明、浸蜡和包埋。石蜡切片片厚4 μm，每个标本取4片，行免疫组织化学染色。

1.3 免疫组织化学检测 所用试剂PCNA和Bax一抗小鼠抗人单克隆抗体、C-fos一抗兔抗人多克隆抗体及其辅助试剂盒均购于北京中杉生物技术有限公司。C-fos免疫组化染色采用SP法，即切片常规脱蜡至水，微波抗原修复，3%过氧化氢灭活内源性酶，正常山羊血清封闭，滴加一抗(抗体浓度为1∶120)，生物素化山羊抗兔血清(二抗)，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液(在以上各步之间均用PBS洗涤5 min×3次)，DAB显色，自来水冲洗，苏木精轻度复染，然后脱水、透明、中性树胶封片，显微镜观察。PCNA和Bax免疫组化染色采用PV法:即切片常规脱蜡至水，3%过氧化氢灭活内源性酶，微波抗原修复，滴加一抗(抗体浓度为1∶100)，PV9005(在以上各步之间均用PBS洗涤5 min×3次)，DAB显色，自来水冲洗，苏木精轻度复染，然后脱水、透明、中性树胶封片，显微镜观察。用PBS替代一抗、二抗作阴性对照，用已知阳性片作阳性对照。

1.4 图像分析 切片经染色后，PCNA和C-fos蛋白表达阳性细胞的细胞核呈淡黄色、黄色或深黄色，细胞膜/质不着色;Bax蛋白表达阳性细胞的细胞膜/质呈淡黄色、黄色或深黄色，细胞核不着色。用NIS-DR专业图像处理分析软件(日本Nikon)分别测定舌尖、舌体和舌根某一高倍视野下上皮组织、肌组织和纤维组织内PCNA和C-fos蛋白阳性染色细胞的数量，每张切片随机选取3个视野，对每份样本的4张切片的3个视野阳性染色细胞数量取平均值，即得舌尖、舌体和舌根上皮组织、肌组织和纤维组织内PCNA和C-fos蛋白阳性染色细胞平均数，把上述3个部位的上皮组织、肌组织和纤维组织内PCNA和C-fos蛋白阳性染色细胞平均数相加后再除以3得到舌上皮组织、肌组织和纤维组织内PCNA和C-fos蛋白阳性染色细胞平均数。

2 结果

2.1 PCNA蛋白在舌组织中的表达 第2个月龄时，PCNA蛋白在人胚舌尖、舌体和舌根上皮组织层部分细胞、舌肌组织和纤维组织内有少数细胞呈阳性表达(图1A)，其中舌尖最多，舌体次之，舌根最少。第3个月龄时，PCNA蛋白呈阳性或强阳性广泛表达于舌上皮组织层，舌肌组织内部分细胞呈阳性表达，其中舌尖最多，舌体和舌根相似(图1B)。第4个月龄时，PCNA蛋白在舌尖、舌体和舌根上皮组织层内阳性细胞数较第3个月胎龄时期明显减少，PCNA蛋白主要表达于上皮基底层少数细胞;在舌肌组织内，与第3个月胎龄时期相比，PCNA蛋白阳性表达数量增多(图1C、D)。因此人胚胎第2－4个月龄段，PCNA蛋白在舌上皮组织的阳性染色细胞数量有不同变化:先增高再降低(均P＜0.01);而舌肌组织和纤维组织内PCNA蛋白阳性染色细胞数量则以第4个月龄最多，第3个月龄次之，第2个月龄最少(P ＜0.05)，见表1。

图1 人胚第2～4个月龄时PCNA蛋白在舌组织中的阳性表达Fig.1 At the second，third and fourth month of human embryo，positive expression of PCNA protein in the tongue tissue

表1 PCNA和C-fos蛋白在人胚胎舌组织的阳性染色细胞计数Table 1 The number of PCNA and C-fos positive cells in human embryonic tongue tissue(，/Hp)

表1 PCNA和C-fos蛋白在人胚胎舌组织的阳性染色细胞计数Table 1 The number of PCNA and C-fos positive cells in human embryonic tongue tissue(，/Hp)

PCNA C-fos胎龄/月 蛋白阳性表达细胞数量 蛋白阳性表达细胞数量上皮组织 肌组织和纤维组织 上皮组织 肌组织和纤维组织239 .10 ±13.44 22.30 ±6.57 25.10 ±7.91 24.50 ±4.674 26.00 ±9.02 32.40 ±14.72 17.40 ±2.80 28.00 ±7.75 F值20.20 ±7.13 17.20 ±8.99 0 03 8.987 5.270 8.426 1.497 P值 ＜0.01 ＜0.05 ＜0.01 ＞0.05

2.2 C-fos蛋白在舌组织中的表达 第2个月龄时，C-fos蛋白在人胚舌组织内无阳性表达。第3个月龄时，C-fos蛋白呈阳性或强阳性广泛表达于舌上皮组织层，舌肌组织内部分细胞呈阳性表达，其中舌尖最多，舌体和舌根相似(图2A)。第4个月龄时，C-fos蛋白在舌尖、舌体和舌根上皮组织层内阳性细胞数较第3个月胎龄时期明显减少;在舌肌组织内，与第3个月胎龄时期相比，C-fos蛋白阳性表达未见明显变化(图2B，表1)。

图2 人胎第3、4个月龄时C-fos蛋白在舌组织中的阳性表达Fig.2 At the third and fourth month of human fetus，C-fos protein positive expression in the tongue tissue

2.3 Bax蛋白在舌组织中的表达 Bax蛋白仅在第3个月胎龄时呈弱阳性表达于舌肌组织和上皮组织内少数细胞(图3)。

第2、3 个月龄舌组织内 PCNA、C-fos、Bax蛋白阴性对照结果见图4。

3 讨论

舌是口腔中的重要组织器官，在人类咀嚼、吞咽和语言表达等生理功能方面发挥着重要作用。舌的异常发育不仅影响上述生理功能，还常引起口腔邻近组织器官的发育畸形，甚至影响消化系统和神经系统的功能。研究人胚胎舌生长发育时期舌组织细胞增殖规律，有助于人们进一步了解舌的生理功能和发病机制。人胚胎发育到第7周时，舌完全形成，位于口腔中央，在随后的胚胎发育过程中，它参与吞咽羊水、口腔塑型等重要生理功能。

图3 人胎第3个月龄时，Bax蛋白(↑)在舌组织中的弱阳性表达(免疫组织化学法 ×400)Fig.3 Atthe third month ofhuman embryo，Bax protein weak positive expression(↑)inthetongue tissue，using immunohistochemical methods×400

PCNA在进化上高度保守，是一种在增殖细胞中合成或表达的核内多肽，对DNA复制和调节起着重要作用［7］。C-fos与DNA结合具有直接调节转录因子的作用，在静止细胞受到生长刺激时迅速表达;在胚胎细胞的发育过程中，C-fos是一种细胞分化的诱导因子，对细胞的生长、分化及增殖起促进作用［8］。也有研究表明，C-fos表达增加可能与凋亡的反应性表达增强(促进特异性细胞凋亡)有关［9］。本研究结果显示，第2个月胚龄时，仅见PCNA蛋白在人胚舌上皮组织层部分细胞和舌肌组织内少数细胞呈阳性表达;第3个月胎龄时，PCNA和C-fos蛋白在上皮组织细胞阳性表达数量最多;第4个月胎龄时期，舌肌组织内PCNA蛋白阳性表达数量继续增高，C-fos蛋白阳性表达未见明显变化。这提示舌肌组织细胞的增殖分化整体上晚于舌上皮组织细胞，人胚胎舌上皮组织细胞增殖分化的高峰期在第3个月胎龄段;人胚胎发育第2个月胚龄时，舌的上皮和肌组织等都处于发育的早期阶段，细胞比较幼稚，大多数正处于细胞分化、增殖前物质聚集、DNA合成的准备阶段，细胞增殖信号表达较低;到第3个月胎龄时，舌上皮组织细胞经过前一段较长时期的物质储备，大部分细胞已具备增殖分化能力。为了满足胚胎舌组织快速增殖分化发育的需要，在一些刺激因子的诱导调控下，促进细胞增殖。结合Bax蛋白在舌组织内部分细胞呈弱阳性表达的实验结果，我们认为此期C-fos蛋白表达的增高与凋亡的反应性表达增强无关，C-fos的身份可能是作为细胞分化的诱导因子，与DNA结合调节有转录活性的转录因子，活化细胞，刺激细胞增殖［8］。第4个月胎龄时，舌上皮组织内PCNA和C-fos蛋白阳性表达下降，说明人胚胎舌上皮组织层基本发育完善。关于PCNA在胚胎舌组织发育中的表达规律，Nagata等［10］在小鼠胚胎舌发育的研究中发现，PCNA蛋白阳性表达开始于胚胎发育的第9天舌枕部体节细胞，到胚胎发育的第11天，PCNA蛋白在舌肌组织细胞的阳性表达达峰值，随后下降直到出生，这一结果与我们的实验结果基本一致，说明人和小鼠舌发育过程中，细胞增殖均遵循先升高再降低这一规律。

图4 人胎第2、3个月龄时，舌组织内PCNA、C-fos、Bax蛋白的阴性对照结果(免疫组织化学法 ×400)Fig.4 At the second and third months of human embryo，PCNA，C-fos and Bax protein negative control results in the tongue tissue，using immunohistochemical methods×400

Bax属于Bcl-2家族成员，参与细胞线粒体凋亡途径，生理作用是拮抗Bcl-2，促进细胞凋亡［3－4］。本实验结果显示，第 2～4个月胎龄段，Bax蛋白仅在第3个月胎龄时的舌组织内少部分细胞呈弱阳性表达。结果提示人胚胎舌组织细胞在发育的早期，细胞以增生为主，但分化发育的过程中肯定存在细胞凋亡，胚胎舌组织细胞发生凋亡的主要途径可能不是Bax基因通路，具体机制有待进一步研究。

综合上述，我们认为PCNA、C-fos参与调控人胚胎舌内组织细胞的分化发育过程。

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