HPLC法测定盐酸伊立替康注射液的含量和有关物质

余春梅，杨秀丽，郑小锋，陈家香，邹意琼，陈 兰（西南药业股份有限公司药物研究所，重庆 400038）

盐酸伊立替康为喜树等植物中含有的抗肿瘤生物碱——喜树碱的水溶性衍生物，其可抑制Ⅰ型DNA拓朴构型异构酶而阻碍DNA的合成，从而显示抗肿瘤活性。本品及其代谢产物SN-38对细胞周期S期具有特异性抑制作用[1-3]。其制剂制备和应用较多，本公司生产的盐酸伊立替康注射液即是其中的一种。为控制该产品质量，笔者建立了测定盐酸伊立替康注射液[4-6]的含量和有关物质的高效液相色谱（HPLC）法。结果表明，建立的方法简便、快捷、准确，适用于盐酸伊立替康制剂的质量控制。

1 材料

1200型HPLC仪、紫外检测器、二极管阵列检测器（美国Agilent公司）；AB204-E分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；H66 MC超声仪（无锡超声电子设备厂）。

盐酸伊立替康注射液（自制，批号:110701、110702、110703，规格:2 ml∶40 mg）；盐酸伊立替康对照品（中国食品药品检定研究院，批号:100767-201102，纯度:93.4%）；甲醇、乙腈均为色谱纯，磷酸二氢钠等均为分析纯，水为注射用水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性

色谱柱:Hypersile Luna（2）C18（250mm×4.6mm，5µm）；流动相:水溶液（含0.02 mol/L磷酸二氢钠和0.008 mol/L辛烷磺酸钠）-乙腈-甲醇＝59∶17∶24（V/V/V），流速:1.5 ml/min；检测波长:255 nm；柱温:40℃；进样量:15µl。在此色谱条件下，取有关物质供试品溶液进样，盐酸伊立替康与有关物质峰的分离度大于1.5，盐酸伊立替康的拖尾因子小于1.5，详见图1。

图1 系统适用性试验图谱1.盐酸伊立替康Fig 1 HPLC chromatograms of system suitability1.irinotecan hydrochloride

2.2 测定方法

2.2.1 含量测定。取本品，加流动相溶解并稀释制成每1 ml约含1.0mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液。另取对照品适量，同法操作，作为对照品溶液。取供试品溶液和对照品溶液各15µl注入色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。

2.2.2 有关物质测定。精密量取“2.2.1”项下供试品溶液1 ml置于100 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，作为对照溶液。取对照溶液15µl注入色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20%；另取供试品溶液15µl，注入色谱仪，记录色谱图至主成分色谱峰保留时间的3倍。供试品溶液中如有杂质峰，单个杂质峰不得大于对照溶液主峰0.2倍（0.2%），各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积（1.0%）。

2.3 方法学验证

2.3.1 最低检测限。取对照品溶液，以流动相稀释制成系列浓度，分别进样，以信噪比为3时确定检测限为1.2 ng。

2.3.2 线性试验。取盐酸伊立替康对照品适量，精密称定，加流动相溶解并制成98.5、197.0、295.5、492.5、985.0µg/ml的溶液，分别进样，记录峰面积。以峰面积（A）对质量浓度（c）进行回归分析，得回归方程为A＝－196.12+12.01 c（r＝0.99997）。结果表明盐酸伊立替康检测质量浓度线性范围为98.5～985.0µg/ml。

2.3.3 精密度试验。取“2.2.1”项下的对照品溶液，连续进样6次，测定峰面积，计算RSD为0.09%，表明本法精密度好。

2.3.4 回收率试验。取样品适量，加流动相溶解制成含盐酸伊立替康高、中、低（1.2、1.0、0.8mg/ml）3种水平的溶液各3份，取15µl注入色谱仪，记录峰面积；另取盐酸伊立替康对照品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每1 ml约含1.0 mg的溶液，同法操作；按外标法以峰面积计算。结果，盐酸伊立替康高、中、低3种水平的加样回收率分别为99.4%（99.4%、99.6%、99.3%，RSD＝0.12%）、99.8%（99.9%、99.8%、99.7%，RSD＝0.10%）、99.6%（99.7%、99.5%、99.5%，RSD＝0.15%），平均回收率为99.6%（RSD＝0.12%）。

2.3.5 溶液稳定性试验。取“2.2.1”项下的供试品溶液，在0、2、4、6、8 h时，分别取样进样分析，测定主成分含量和有关物质的量。结果，单个杂质和总杂质量基本无变化，主成分、单个杂质和总杂质含量的RSD分别为0.15%、1.72%、0。

2.3.6 耐用性试验。①流动相比例变化的影响:将流动相的比例调整±5%，取同一份供试品溶液，记录杂质峰的峰面积，以峰面积计算RSD。结果RSD＝0.78%（n＝8），表明调整流动相比例±5%时，方法耐用性良好。②柱温的影响:将柱温分别调为35、40、45℃，取同一份供试品溶液，照“2.2.2”项下方法操作，记录杂质峰峰面积，以峰面积计算RSD。结果RSD＝0.29%（n＝6），表明柱温在35～45℃变化时，耐用性良好。

2.3.7 专属性试验。供试品原液:精密称取样品，配制成含盐酸伊立替康约为1.0 mg/ml的溶液，作为供试品原液。

精密称取样品5份，均加适量流动相溶解。1份加入1 mol/L盐酸溶液5 ml，80℃反应2 h，加1 mol/L氢氧化钠溶液5 ml中和，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为酸破坏溶液；1份加1 mol/L氢氧化钠溶液1 ml，80℃反应2 h，加1 mol/L盐酸溶液1 ml中和，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为碱破坏溶液；1份加30%过氧化氢溶液2 ml，80℃反应2 h，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为氧化破坏溶液；1份在100℃下加热4 h，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为高温破坏溶液；1份在（4500±500）lx照度下照射48 h，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为光照破坏溶液。另精密称取按处方比例配制的空白辅料适量，配制成空白辅料溶液。分别取上述7种及对照品溶液各15µl进样，记录色谱图。结果显示，辅料不干扰主成分和有关物质测定，各杂质峰与主峰均能达到基线分离，表明本法专属性良好。破坏性试验色谱见图2。

图2 破坏性试验色谱图A.空白辅料溶液；B.供试品原液；C.酸破坏溶液；D.碱破坏溶液；E.氧化破坏溶液；F.高温破坏溶液；G.光照破坏溶液；H.对照品溶液；1.盐酸伊立替康Fig 2 HPLC chromatograms of destructive testA.blank excipient solution；B.sample stock solution；C.solution destroyed by acid；D.solution destroyed by alkali；E.solution destroyed by oxidation；F.solution destroyed by high temperature；G.solution destroyed by light；H.substance control solution；1.irinotecan hydrochloride

2.3.8 样品测定。照“2.2”项下方法测定3批盐酸伊立替康注射液的含量及有关物质，结果见表1。

表1 样品测定结果Tab 1 Determination results of samples

3 讨论

（1）本文主要是建立盐酸伊立替康注射液的有关物质和主成分含量测定方法。由于原料药质检时已经对合成过程的中间体和副产物进行了控制，且在稳定性研究中这些杂质没有增加，因此建立有关物质方法时，只对单个杂质和总杂质的限度进行了严格的控制，而未控制已知杂质。

（2）取盐酸伊立替康破坏性试验各溶液，经二极管阵列检测器检测。结果，盐酸伊立替康和破坏产生的杂质均在255 nm波长处有最大吸收，且溶剂和辅料在此波长处未见干扰，故确定本试验检测波长为255 nm。

（3）在前期流动相的筛选中，曾设计了多组不同组成（磷酸盐-甲醇、磷酸盐-乙腈、辛烷磺酸钠-甲醇、辛烷磺酸钠-乙腈、辛烷/磷酸盐-甲醇、辛烷/磷酸盐-乙腈、辛烷/磷酸盐-甲醇-乙腈）流动相系统。结果认为，乙腈-甲醇-水溶液（含有适量磷酸二氢钠和辛烷磺酸钠）组成的流动相系统优于单一的甲醇和乙腈与缓冲盐组成的系统。通过调整其不同的体积比，如辛烷/磷酸盐-乙腈-甲醇（50∶25∶25）、（55∶20∶25）、（59∶16∶25）、（59∶17∶24）等，最终确立了本试验采用的流动相。在该流动相下，主峰出峰时间合适，杂质峰与主峰能够完全分离，适合本品主成分含量和有关物质的测定。

（4）本方法流动相中有离子对试剂，虽然可能对分析柱损害较大，但可以更好地保持主峰的峰形，使其拖尾因子符合要求，测定结果更准确。

（5）破坏性试验中，由于本品在常温下反应时基本无新的降解产物产生，故均在80℃下进行破坏试验。

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