亚慢性镉中毒肾功能性损伤小鼠模型的研究

李颖超，武 昕，严家荣，钟志勇，黄 威，唐小江(山西医科大学公共卫生学院，太原 03000;广东省医学实验动物中心比较医学实验室;通讯作者，E-mail:river-t@6.com)

镉(cadmium，Cd)是一种对人体危害极大的重金属，能通过多种途径进入机体，不易排出，半衰期长达数十年，对肝脏、肾脏、骨骼、生殖系统等造成严重损害［1］。1993年，国际癌症研究中心(IARC)将镉确定为ⅠA级致癌物，即人类的致癌毒物［2］。但目前尚没有针对镉中毒的特效药。2006年，唐小江博士发明了一种具有自主知识产权的新型络合物—N-(2，3，4，5，6－五羟基己基)－(N －二取代甲酸钠基)－L－甲硫氨酸钠［3］，前期实验表明，该络合物具有良好的驱镉效果［4］。肾脏作为镉发挥毒作用的重要靶器官之一，在慢性镉中毒早期即可出现功能性损伤，但关于肾脏功能性损伤的动物模型报道较少，本研究拟建立亚慢性镉中毒肾功能性损伤但无明显器质性损伤的小鼠模型，再使用该络合物进行驱镉治疗，以模拟人类在接触镉早期出现肾功能改变时即进行驱镉治疗，进一步评价其驱镉治疗效果。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

氯化镉(CdCl2·2.5H2O)，分析纯，天津市福晨化学试剂厂;盐酸、硝酸、高氯酸、过氧化氢溶液，均为优级纯，购自广州化学试剂厂;巯基乙醇(ME)，美国Sigma公司;尿β2微球蛋白ELISA试剂盒和尿视黄醇结合蛋白ELISA试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司;肌酐测定试剂盒(碱性苦味酸法)购自南京建成生物工程研究所;基体改进剂(0.02%氯化钯 +0.1%硝酸+0.01%TritonX －100)。

原子吸收分光光度计(900T，Perkin Elmer公司);荧光显微镜(BX41，Olympus公司);全波长酶标仪(Multiskan Go，Thermfisher公司)。

1.2 实验动物及饲养环境

SPF级NIH小鼠，雄性，26只，体重18－22 g，由广东省医学实验动物中心提供［实验动物生产许可证号:SYXK(粤)2008－0002］。动物饲养在广东省医学实验动物中心SPF级动物房［实验动物使用许可证号:SYXK(粤)2008－0002］，动物房温度为20－26℃，相对湿度在40% －70%。自由进食和饮水，颗粒饲料和饮用水均由广东省医学实验动物中心提供，本实验经广东省医学实验动物中心动物伦理委员会审批批准。

1.3 染毒药物的配制

按照表1所述进行各浓度染毒药物的配制，配制完成后，使用0.22 μm微孔滤膜过滤灭菌，然后在4℃条件下保存，使用时取出待药物恢复至室温时再进行腹腔注射。

表1 亚慢性镉中毒肾功能性损伤实验染毒药物配制Tab 1 Preparation methods of the solutions for injection in experiment on subchronic kidney function damage induced by cadmium

1.4 分组及染毒

动物检疫合格后，选取体重最接近的24只动物，按体重随机分为4组，每组6只，分别为正常对照组，低、中、高剂量组。高、中、低剂量组动物分别腹腔注射表1中序号2－4中的CdCl2和ME混合溶液，注射剂量为 10 ml/kg，1 次/d，连续5 d，总染镉剂量分别为3.37，1.69，0.84 mg Cd/kg，对照组注射生理盐水，末次染毒后各组动物观察35 d。

1.5 样本收集及检测

观察结束后，代谢笼加冰盒收集小鼠禁食、不禁水情况下12 h尿液，按试剂盒说明测定尿中的β2－微球蛋白(UBMG)、视黄醇结合蛋白(URBP)、肌酐(Cr)含量。然后断头取血0.6 ml，肝素抗凝，用于测定镉含量。解剖小鼠，取出心、肝、脾、肺、肾、脑、睾丸等脏器，称重后计算脏器系数。左肾、左侧睾丸用4%甲醛溶液固定用于病理检查，右肾用于测定镉含量。脏器系数=脏器质量/体重×100%。

血液用基体改进剂稀释10倍，右肾消化后，采用原子吸收光谱仪测定镉含量，测定波长228.8 nm;狭缝宽度0.70 nm;灯电流4.0 mA。积分模式:峰面积;背景校正:塞曼校正法。

1.6 统计分析

2 结果

2.1 一般情况

各组动物在整个实验过程中与正常对照组表现基本相同，未出现死亡及其他异常情况。实验结束后，各实验组动物的体重与正常对照组相比，差异无统计学意义(P ＞0.05，见表2)。

表2 实验各组动物的体重比较(±s，n=6)Tab 2 Comparison of body weight among four groups(±s，n=6)

表2 实验各组动物的体重比较(±s，n=6)Tab 2 Comparison of body weight among four groups(±s，n=6)

与正常对照组相比，*P＜0.05

组别 总染镉剂量(mg Cd/kg) 体质量/g正常对照组46.7 ±2.5低剂量组 0.84 46.4 ±4.3中剂量组 1.69 46.7 ±3.1高剂量组0 3.37 46.1 ±2.8

2.2 尿小分子蛋白测定结果

高剂量组动物的UBMG与正常对照组相比显著升高(P＜0.05)，低、中剂量组与正常对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。三个剂量组动物的URBP与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05，见表3)。

2.3 血镉和肾镉含量测定结果

低、中、高剂量组动物的血镉和肾镉含量均显著高于正常对照组，差异有统计学意义(P＜0.05，见表4)。

表3 各组动物的尿β2－微球蛋白、尿视黄醇结合蛋白测定结果(±s，n=6)Tab 3 Comparison of UBMG and URBP among four groups(±s，n=6)

表3 各组动物的尿β2－微球蛋白、尿视黄醇结合蛋白测定结果(±s，n=6)Tab 3 Comparison of UBMG and URBP among four groups(±s，n=6)

与正常对照组相比，*P＜0.05

组别 总染镉剂量/(mg/kg) 尿视黄醇结合蛋白/(ng/mg Cr)β2－微球蛋白/(ng/mg Cr)14.80 ±0.380 18.021 ±10.382低剂量组 0.84 11.17 ±0.131 18.393 ±13.404中剂量组 1.69 12.09 ±0.280 22.812 ±11.278高剂量组 3.37 12.20 ±0.292 108.520 ±24.690正常对照0*

表4 各组实验动物的血镉、肾镉含量测定结果(±s，n=6)Tab 4 Comparison of blood cadmium and renal cadmium among four groups(±s，n=6)

表4 各组实验动物的血镉、肾镉含量测定结果(±s，n=6)Tab 4 Comparison of blood cadmium and renal cadmium among four groups(±s，n=6)

与正常对照组相比，*P＜0.05

组别 总染镉剂量(mg/kg) 血镉/(μg/L) 肾镉/(μg/g)0.39 ±0.23 0低剂量组 0.84 15.20 ±3.60* 5.33 ±0.55*中剂量组 1.69 20.12 ±5.35* 10.03 ±1.00*高剂量组 3.37 43.42 ±6.69* 23.25 ±4.98正常对照组0*

2.4 脏器观察结果

各组动物的脏器系数见表5。低剂量组动物心脏的脏器系数与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05)，但，中、高剂量组与对照组相比无明显变化(P＞0.05)。中、高剂量组动物的脾脏脏器系数与对照组相比显著升高(P＜0.05)，各剂量组的其他脏器的脏器系数与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。各组动物的左肾、左侧睾丸病理检查均未发现明显病理变化，见图1，2。

图1 染镉小鼠左肾组织病理观察 (HE，×200)Fig 1 Pathological changes of left kidney in mice after exposure to cadmium (HE，×200)

图2 染镉小鼠左侧睾丸组织病理观察 (HE，×200)Fig 2 Pathological changes of left testicle in mice after exposure to cadmium (HE，×200)

表5 各组动物脏器系数的比较(±s，%，n=6)Tab 5 Comparison of relative organ parameters among four groups(±s，%，n=6)

表5 各组动物脏器系数的比较(±s，%，n=6)Tab 5 Comparison of relative organ parameters among four groups(±s，%，n=6)

组别 总染镉剂量(mg/kg)睾丸 肾正常对照组 0 0.361 ±0.039 4.289 ±0.368 0.231 ±0.066 0.381心肝脾肺脑±0.072 0.863 ±0.045 0.423 ±0.078 1.003 ±0.077低剂量组 0.84 0.446 ±0.069* 4.146 ±0.208 0.258 ±0.052 0.408 ±0.107 0.868 ±0.127 0.434 ±0.062 1.210 ±0.107中剂量组 1.69 0.414 ±0.033 4.349 ±0.216 0.472 ±0.098* 0.499 ±0.073 0.922 ±0.086 0.426 ±0.049 1.140 ±0.105高剂量组 3.37 0.389 ±0.047 4.251 ±0.308 0.440 ±0.161* 0.497 ±0.076 0.943 ±0.074 0.433 ±0.076 1.095 ±0.178

3 讨论

肾脏是镉发挥毒作用的主要靶器官之一。国内外许多学者对镉的肾脏毒性进行了研究［5－9］。有研究表明，与单次染毒相比，对动物进行多次镉染毒更接近于人体长期接触镉的情况［10］，但目前对于镉中毒的肾损伤研究多在于关注镉染毒后对于机体器官系统造成的损伤状况［11，12］。镉对肾脏造成的器质性损伤是较难用药物逆转的，因此，采用肾脏器质性损伤动物模型来研究驱镉药物容易出现假阴性的结果。本研究为深入研究新型驱镉络合物的驱镉作用机制，采用NIH小鼠制备肾脏功能性损伤模型，结果发现，小鼠染镉后，肾镉和血镉含量与对照组相比均显著性升高(P＜0.05)，且未见肾脏的病理改变。

研究中选取的尿β2－微球蛋白和视黄醇结合蛋白均为反映肾小管功能损伤情况的指标［13，14］。我国最新颁布《职业性镉中毒诊断标准》(GBZ 17－2002)中也采用尿β2－微球蛋白和视黄醇结合蛋白作为慢性镉中毒的尿蛋白检测指标。本研究发现，高剂量组动物的尿β2－微球蛋白含量显著高于对照组，说明高剂量组动物的肾小管的重吸收功能受到了破坏，但尿视黄醇结合蛋白含量未见显著性差异。推测视黄醇结合蛋白在反映镉中毒程度的情况时敏感性可能不如尿β2－微球蛋白。袁华敏等的研究表明，尿β2－微球蛋白和视黄醇结合蛋白对镉等重金属超标的诊断功能的是相互独立的，二者不具有绝对的相关性［15］。黄波等曾报道，当人体镉摄入量达50 mg以上时，尿β2－微球蛋白即出现显著升高，而尿视黄醇结合蛋白在镉摄入量达200 mg以上时才出现明显改变［16］。本实验验证了文献报道的实验结果。

实验中对小鼠染毒时使用的巯基乙醇含有巯基，可与镉离子结合，在体内加快镉向肾脏的转移，在一定程度上能缩短造模时间［17］。镉是一种低温元素，而血样基体复杂，在用原子吸收光谱仪测定血镉时，样品的灰化过程中镉易蒸发损失，且易受到基体的干扰，加入基体改进剂可减少灰化过程中镉的损失，减少背景吸收，增加测定的准确性［18］。

综合本次研究的结果，认为按6.78 mg Cd/kg的剂量对小鼠腹腔注射，1次/d，连续5 d，末次染毒后观察35 d可建立小鼠亚慢性镉中毒肾功能损伤模型，可用于驱镉药物的筛选和作用机制的研究。有关镉离子如何进入组织细胞以及驱镉药物如何在体内、体外起到驱镉作用及其作用机制，有待深入研究。

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