惊厥发作不同时相下脑红蛋白表达的初步研究

刘广韬，潘隆盛，尚爱加，刘 策，伍 刚，李双彦，周敬安(解放军第309医院神经外科，北京 0009;解放军总医院神经外科;通讯作者，E-mail:shangaij@63.com)

癫痫是神经系统疾病中常见的发作性疾病，作为高耗氧、低氧储备的脑细胞对于缺氧的耐受力极弱。在癫痫发作过程中所致的缺氧间接导致的脑损伤也越来越多地被关注［1］。脑红蛋白(neuroglobin，NGB)是德国学者Burmester等［2］在2000年首先在人和小鼠脑内发现的一类继血红蛋白(hemoglobin，Hb)和肌红蛋白(myoglobin，Mb)外的第三类携氧球蛋白。NGB与氧亲和力高，能可逆性地结合氧并特异性地向脑组织供氧，增强脑组织对氧的利用率。NGB的表达强度与脑组织缺氧损伤程度负相关，是一种内源性神经保护因子［2］。本研究采用经硬脑膜电刺激致大鼠惊厥模型，观测不同时相下大鼠惊厥后大脑皮层NGB的表达变化情况，旨在探讨与缺氧性脑损伤密切相关的癫痫惊厥发作和NGB表达之间的相应变化关系及NGB在惊厥发作时的脑保护作用和意义。

图1 大鼠惊厥发作后CA1区细胞HE染色形态学表现 (×100)Fig 1 Morphology of hippocampus cells in CA1 area after seizure by HE staining (×100)

图2 癫痫不同时点额叶皮层NGB免疫组化染色结果 (×400)Fig 2 HGB immunohistochemical staining results of NGB expression in cortex after seizure for different time (×400)

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康成年雄性SPF级SD大鼠25只，体重240-280 g，由解放军总医院实验动物中心提供，动物合格证号:SCXK(京)2006-0009，北京维通利华实验动物技术有限公司，光暗周期12 h，环境温度(20±2)℃。随机分为:假手术组，5 min组，15 min组，30 min组，30 min延迟组(发作 30 min后延迟1 h取材)，每组5只。

1.1.2 试剂及器材 一抗:小鼠抗大鼠NGB单克隆抗体(编号:IE12)，工作浓度1∶100(军事医学科学院提供)。免疫组化染色试剂盒:Histostain-Plus Kit LAB-SA Detection System(Cat.No.85-6643，SUNBIO公司)，其中含试剂A(蓝色液体):封闭用正常山羊血清工作液;试剂B(黄色液体):生物素化二抗工作液;试剂C(橙色液体):辣根酶标记链霉卵白素工作液。二氨基联苯胺试剂盒(Diaminobenzidine，DAB)Kit(Cat.No.00-2014，SUN BIO 公司)，10%中性甲醛(pH7.3)，0.01 mol/L(pH7.5)磷酸盐缓冲生理盐水(Phosphate-buffer saline，PBS)，0.01 mol/L 柠檬酸缓冲液(Citratebuffersolution，CB)，多聚赖氨酸，苏木素染液(Mayer法)。包埋机:KD-BM生物组织包埋机，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司;切片机:LEICA2016，德国;显微镜:Nikon i50，日本;水浴锅:SHA-C，江苏金坛市荣华仪器制造有限公司。刺激器:日本光电工业株式会社，型号:SEN-7103。分离器:日本光电工业株式会社，型号:SS-102J。小动物脑电图记录仪:Neurocop，型号:UE-16A。

1.2 方法

1.2.1 脑组织标本取材 参考Voskuyl等［3］方法建立大鼠电刺激致痫模型，10%水合氯醛按0.4 ml/100 g进行腹腔注射麻醉，台式牙科电钻分别于左右两侧冠状缝前3 mm、中线旁开3 mm位置钻骨孔植入电极，固定后缝合头皮备用。发作强度以到达Racine［4］Ⅳ-Ⅴ级，脑电图出现尖波、棘波及棘(尖)慢复合波等异常放电波形为造模达标。根据实验设计通过电流控制发作时间，各组大鼠于相应时间点快速断头取脑，假手术对照组仅行电极植入手术但不进行电刺激，于术后24 h取材。取材后标本浸泡于4%多聚甲醛PBS溶液中4℃冰箱过夜。取材:囟门后2.8 mm做冠状切面，自切面向头侧3 mm作另一切面取材。置4%多聚甲醛PBS溶液再固定18 h后石蜡包埋、切片(厚度4 μm)，然后分别进行HE染色及免疫组化染色。

1.2.2 HE染色 石蜡切片常规脱蜡至水，二甲苯Ⅰ10 min，二甲苯Ⅱ10 min，无水乙醇5 min ×2，95%乙醇5 min，85%乙醇5 min，75%乙醇5 min，流水冲洗15 min;苏木素染色液3 min;自然水洗，1%盐酸乙醇化数秒;流水冲洗、温水10 min;0.5%伊红乙醇染色液1-2 min;50%乙醇适当脱水;75%乙醇脱水数秒;85%乙醇脱水数秒;95%乙醇脱水数秒;100%乙醇脱水;二甲苯透明5 min×2次;中性树脂封片;镜下观察结果。

1.2.3 免疫组化染色 石蜡切片常规脱蜡至水;抗原修复:将切片连同柠檬酸缓冲液放入高压锅内，加热至产生喷气，并持续2 min，压力锅离开热源;取出并恢复至室温，PBS冲洗;3%H2O2去离子水孵育20 min，消除内源性过氧化物酶活性，PBS冲洗;滴加试剂A室温孵育10-15 min;滴加适当比例稀释的一抗NGB(1∶100)放入湿盒内4℃过夜;取出并恢复至室温，PBS冲洗;滴加试剂B，室温或37℃孵育10-15 min;PBS冲洗后滴加试剂C，室温37℃孵育15 min;PBS冲洗，DAB显色剂显色;自来水充分冲洗;苏木素复染，脱水，透明;中性树脂封片。

1.2.4 图像分析 每个标本选取5张切片进行图像分析。经光学显微镜200倍放大倍率下，选取额叶皮层4个不同视野区域进行显微摄影拍照。使用由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health，NIH)开发的Image J(版本1.42q)软件进行分析处理后，由软件计数照片中的阳性细胞数量。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 经硬脑膜电刺激致惊厥发作后脑组织HE染色形态学表现

各发作组脑组织大体标本无肉眼可见改变，体积、形态与正常对照脑组织无可见差异。HE染色后，假手术组(图1A，见第323页)与惊厥发作(图1B，见第323页)各时相组未见明显差异，光镜下见皮层细胞排列有序，结构完整，组织间隙无增大，锥体细胞核呈蓝色清晰可见，细胞膜完整。

2.2 经硬脑膜电刺激致惊厥发作后额叶皮层NGB免疫组化染色

标本经DAB显色后，阳性细胞表现为棕黄色的NGB 免疫反应(NGB-immunoreactive，NGB-IR)，背景色淡，神经元胞质中见NGB-IR阳性物质表达，神经突起中也可见少量阳性表达。

假手术组大脑皮质中广泛分布NGB-IR阳性细胞，其中以额叶、颞叶NGB-IR阳性细胞数量较多，染色较明显。在海马各区域(CA1-4区)中，NGB-IR阳性细胞主要分布于锥体细胞层，其他部分NGB-IR阳性细胞分布较稀少。惊厥发作组与假手术组相比较，惊厥发作后5 min大鼠额叶皮层中NGB表达即明显增高，并呈逐渐升高，30 min组NGB表达最高，持续惊厥发作停止后1 h的延时组NGB表达则出现明显下降(图2，见第323页)。各惊厥发作组与假手术对照组相比较NGB表达差异具有统计学意义(P＜0.01);惊厥发作各组间相比较，5 min组与15 min组差异不大(P＞0.05);15 min组与30 min组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)，其余各组间差异也具有统计学意义(P＜0.01，见表1)。

3 讨论

大脑占体重的2%，总耗氧却占全身耗氧量的25%，因此脑组织作为神经系统和意识中枢，在组织对氧利用的研究上历来非常被重视。以往人们仅知道Hb和Mb两种携氧蛋白能促进氧的利用。在2000年，Burmester等［2］首先发现并报道了人和小鼠的含有1个血红素结构和蛋白质肽链的一个全新的珠蛋白家族成员，即脑红蛋白(neuroglobin，NGB)，他们通过一系列的动物实验证实，NGB mRNA在脑中高表达，并且其表达程度与相应区域脑组织缺血缺氧后损伤的程度呈负相关。Sun等［5］观察了NGB与皮质细胞缺氧之间的关系，发现随缺氧时间的增加，NGB表达呈逐渐增高趋势，认为低氧可以诱导大脑皮质神经元细胞NGB mRNA和蛋白的表达。由此表明NGB可能能够保护低氧损伤下脑组织。

表1 不同时相大鼠额叶皮层NGB表达情况 (n=5，/HP，±s)Tab 1 NGB expression in rat frontal cortex at different stages(n=5，/HP，±s)

表1 不同时相大鼠额叶皮层NGB表达情况 (n=5，/HP，±s)Tab 1 NGB expression in rat frontal cortex at different stages(n=5，/HP，±s)

与假手术组比较，*P＜0.01;除15 min与15 min比较P＜0.05，5 min与15 min比较P＞0.05，其余各惊厥发作组间均P＜0.01

组别 n 5 630.350±70.150 5 min组 5 1 187.200±41.518*15 min组 5 1 164.850±63.166*30 min组 5 1 209.800±83.695*30 min延迟组 5 966.950±77.166额叶皮层假手术组*

关于本研究中的模型选择，在众多的动物致痫模型中之所以选择急性电刺激模型，主要有以下考虑:(1)NGB对缺氧反应极其敏感，并有一定的延时效应，Sun等［5］报道，培养的HN33细胞在缺氧24 h后，NGB mRNA及蛋白表达均增高。因此，如果选用慢性模型，随着发作次数的延长，间断缺氧频次增加，NGB有可能亦随之表达增加，因此无法判断NGB表达增加是多次发作后的累积效应还是最后一次发作的急性表达，因此选用急性发作模型较好。(2)急性发作模型中，药物致痫模型具有诸多缺点，药物本身对NGB表达有何种影响尚不明确，药物是否会增加或减少NGB的表达暂时还没有相关对照性研究，选用药物致痫模型后其NGB表达结果的可信度有一定的下降。药物致痫后的急性模型，其发作的持续时间无法精确地人为控制，无法让每一只已随机分组的动物根据实验的需要，持续发作相应长的时间。这里有几种情况:①如果发作时间过短，没有达到预定时间即完全停止发作，则NGB表达不能等同于发作更长时间的结果;②如果发作时间过短，但并未完全停止发作，而是呈现出间断发作，则结果与短时发作及持续发作不能等同;③如果发作时间超过预定时间，那么在预定时间到达后如何将正在继续发作中的动物进行标本取材将是一个非常困难的问题;④如果简单的将发作时间相同的动物分组，则失去了保持实验动物分组最基本的随机性原则。(3)放弃使用皮层电刺激模型的原因，皮层电刺激需要将电极直接接入动物大脑皮层，电极会对皮层有一定的压迫作用，在发作过程中，由于惊厥过程动物会出现强直阵挛，尤其是发作时间较长时，电极有可能对皮层形成较大的损伤，这种损伤将会导致NGB在皮层的表达迅速增高［6］，从而影响对结果的判别。(4)放弃使用非持续给电刺激致痫模型的原因，与药物致痫的急性模型具有同样的无法控制发作持续及终止时间的问题。因此，本实验选用经硬脑膜电刺激模型，较好地模拟了惊厥时痉挛强直性大发作状态，通过给予电刺激的持续时间不同，严格模拟了不同的惊厥发作持续时间，通过较大的刺激强度，保证了发作的均一性，不存在各种发作强度形式参杂对NGB表达强度潜在的影响。

本研究运用免疫组织化学的技术，从蛋白质水平初步揭示了大鼠惊厥发作后，大脑额叶皮层神经元NGB的表达规律。从本实验统计分析可以发现，惊厥发作后5 min组、15 min组、30 min组的NGB表达随缺氧耗氧时间增加而呈现出迅速递增趋势。其原因可能与心肌细胞及骨骼肌细胞收缩造成短暂缺血类似，在癫痫发作时神经冲动爆发，对氧的需求量大大增加［7］。随着发作时间持续延长，局部神经元相对缺氧必然越来越重。作为氧的载体，NGB在缺氧发生时迅速出现的高表达对局部组织细胞缺氧压力的缓解和神经元的继发损伤具有重要的神经保护作用。刘新建等［8］的研究证实，脑红蛋白能通过抑制促凋亡蛋白Bax的表达，减少神经细胞的凋亡，发挥其神经保护作用。惊厥发作不同时相的各组间相比较，5 min组与15 min组的NGB表达差异不显著(P＞0.05)，而15 min组与30 min组差异具有统计学意义(P＜0.05)，5 min组与30 min组差异具有统计学意义(P＜0.01)，表明NGB随发作持续时间延长而表达增加并非呈线性趋势，而是呈逐级递增趋势。这可能与大脑皮层耐受缺氧的敏感程度有关，因缺血导致大脑皮层损伤达到最大损伤一半的时间是19.1 min，在海马约为 12.7 min［9］。本实验中30 min组的惊厥发作持续时间刚好超过了上述大脑缺氧耐受的关键时间点，因而NGB表达呈现显著增加。

癫痫持续状态30 min后停止发作，延迟1 h组的NGB的表达较其他惊厥发作组NGB表达明显下降，此种现象的产生可能与随着停止发作的时间延长，脑的耗氧量逐渐降低，神经元功能部分恢复正常有关，需氧量的下降使得NGB表达亦随之减少。章军焰等［10］证实神经细胞在癫痫发作前后数量及活力并无显著性差异，因此，NGB表达于发作后减少可以排除是由于癫痫导致缺氧时间过长引起神经细胞死亡分解所致。NGB于惊厥持续发作状态30 min停止后1 h表达仍明显高于假手术对照组，差异具有统计学意义(P＜0.01)，表明NGB在缺氧后迅速产生，其后的减少过程相对于产生过程则较为缓慢，说明NGB对神经元的保护作用具有持续性的特点，但具体能够持续多长时间有待进一步深入研究。

近年来，已有医务工作者在临床实践中探索高压氧治疗癫痫并取得较好的治疗作用［11，12］，其原理为［13］:高压氧可提高动脉血氧分压，有效地提高血液中的氧浓度，进而增加脑组织的含氧量和氧储备量，促进血氧弥散量和弥散距离，克服了缺氧引起脑水肿时神经细胞与血管间距离增大导致的供氧障碍，促进氧向神经元的扩散，纠正神经元的缺氧状态，促进脑组织有氧代谢，解除缺氧状态，从而使受损神经元正常的功能得以修复，改善脑细胞的电生理功能，减少异常放电。本研究中，惊厥发作后NGB表达随发作持续时间延长而呈持续升高状态，NGB通过提高表达能够将储备氧缓慢释放，起到类似于高压氧能够增加非血红蛋白携氧的作用，进而缓解因癫痫发作引起的相对缺氧状态对神经元的急性损伤。虽然NGB的表达增加并不能直接抑制脑组织的异常兴奋点或是阻断癫痫异常放电的通路，但是NGB作为神经系统特异性氧载体可以通过发挥内源性神经保护作用，减轻癫痫发作尤其是癫痫持续状态对脑组织所造成的缺氧性损害。

Ye等［14］研究发现，在癫痫发作过程中可直接导致细胞凋亡解体的蛋白酶系统caspase-3在利用siRNA沉默NGB后表达水平显著增加，提示癫痫发作时通过增加NGB表达有可能进一步改变caspase-3的表达，进而抑制癫痫发作过程继发性缺氧性损伤导致的神经元凋亡发生。对于NGB的神经保护机制目前尚未完全明了，其在癫痫发作中与其他因素的相互作用关系还有待进一步深入研究。

总之，大鼠惊厥发作后，大脑皮层细胞内的NGB表达呈现出随惊厥发作的持续时间增加而逐级迅速递增，发作结束后NGB的表达即随之下降，但下降速度小于发作时的上升速度，提示NGB参与了惊厥发作过程的脑保护过程，且这种保护作用具有一定的持续性，从新的角度提示了高表达NGB在癫痫发作时对缺氧性脑损伤具有的保护作用，为癫痫的研究提供一种新的思路。

［1］ Yager JY，Armstrong EA，Miyashita H，et al.Prolonged neonatal seizures exacerbate hypoxic-ischemic brain damage:correlation with cerebral energy metabolism and excitatory amino acid release［J］.Dev Neurosci，2002，24(5):367-381.

［2］ Burmester T，Weich B，Reinhardt S.A vertebrate globin expressed in the brain［J］.Nature，2000，407(6803):520-523.

［3］ Voskuyl RA，Dingemanse J，Danhof M.Determination of the threshold for convulsions by direct cortical stimulation［J］.Epilepsy Res，1989，3(2):120-129.

［4］ Racine RJ.Modification of seizure activity by electrical stimulation［J］.Electroencephalogr Clin Neurophysiol，1972，32:281.

［5］ Sun Y，Jin K，Mao XO，et al.Neuroglobin is upregulated by and protects neurons from hypoxic-ischemic injury［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(26):15306-15311.

［6］ 陈雪梅，官鹏，杜显刚，等.大鼠脑外伤后大脑皮质脑红蛋白的表达［J］.中国法医学杂志，2010，25(5):319-326.

［7］ 万选才，杨天祝，徐承焘.现代神经生物学［M］.北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1999:471.

［8］ 刘新建，刘丽娜，温慧敏，等.缺氧缺血性脑损伤新生大鼠海马区脑红蛋白、凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达及其相关性［J］.细胞与分子免疫学杂志，2010，26(10):1040-1042.

［9］ Zivin JA.Factors determining the therapeutic window for stroke［J］.Neurology，1998，50(3):599-603.

［10］ 章军焰，邹丽萍，赵兰峰，等.N-甲基-D-天冬氨酸致痫乳鼠行为学与脑内脑红蛋白表达的研究［J］.中国实用儿科杂志，2006，21(11):867-868.

［11］ 谢金祥.高压氧综合治疗癫痫的经验［J］.中华理疗杂志，1999，22(6):338-340.

［12］ 谢金祥，连文洪.国内应用高压氧治疗癫痫的现状［J］.中华航海医学与高气压医学杂志，2003，10(4):249-251.

［13］ 房广才.临床高压氧医学［M］.北京:华文出版社，1995:311-312.

［14］ Ye SQ，Zhou XY，Lai XJ，et al.Silencing neuroglobin enhances neuronal vulnerability to oxidative injury by down-regulating 14-3-3gamma［J］.Acta Pharmacol Sin，2009，30(7):913-918.