急性心功能障碍大鼠心肌中BNP的表达

高卫民 ，曹志鹏 ，米 丽 ，杜中波 ，前田 均 ，朱宝利 ，

（1.中国医科大学法医学院，辽宁 沈阳 110001；2.太仓市公安局，江苏 太仓 215400；3.日本大阪市立大学医学部法医学教室，大阪 545-8585日本）

心源性猝死是最常见的死因之一，也是法医病理学鉴定的任务之一。传统的法医病理学对心肌损伤的认定主要集中在形态学指标的检测。然而，一些心源性猝死的案件中引起猝死的病变或形态学指标往往缺乏特异性，这类死亡可能与心功能障碍直接相关，例如一些心肌病、心律失常以及一些没有明显缺血性损伤的缺血性心肌病。因此，客观评价死亡之前的心功能状态能更好地阐明猝死的确切机制，尤其在缺乏典型形态学损伤的心源性猝死的案件中具有重要的法医学意义[1-2]。

研究[3]表明，死后心包液中脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）与氮末端脑钠肽前体（NT-proBNP）浓度的比值与死前心功能状态有很好的相关性，BNP浓度越高，死前的心功能障碍越严重，因此心包液中的BNP浓度能客观反映死前心功能障碍的程度。然而心包液中BNP浓度的升高主要出现在慢性充血性心衰以及部分心肌梗死的案例中，而在一些由急性缺血性心肌病引起的猝死案例中，心包液中BNP则通常很低。由于BNP首先在心肌组织中合成，而后才到达心血和心包液。因此，本实验以大鼠心肌组织作为研究对象，研究大鼠急性心功能障碍时心肌组织中BNP表达的变化规律，探讨心肌组织中BNP表达在急性心功能障碍的法医学诊断中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

兔抗大鼠BNP多克隆抗体（AB1549，美国Millipore 公 司 ），ElivisionTMsuperHRP （Mouse/Rabbit）IHC试剂盒（KIT-9921，福州迈新生物技术开发有限公司），BCA蛋白浓度测定试剂盒（P0010S，上海碧云天生物技术有限公司），预染蛋白marker（SM0671，立陶宛Ferments公司），大鼠BNP特异性ELISA试剂盒（美国 R&D 公司），D9108A RNAiso Plus、DRR037S逆转录试剂盒、DRR081S SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ（Perfect Real Time，日本 TaKaRa Biotechnology公司），ECL发光剂（SC-2048，美国Santa Cruz Biotechnology公司），PRISM®7500 Real-Time PCR System （美国AB公司）等。

1.2 实验动物

中国医科大学实验动物中心提供健康成年雄性SD大鼠，体质量 300～350 g，手术前饲养1周，每天换垫料，饲养室保证空气流通，维持正常的光照时间和黑暗时间。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型制作

参照文献[4]制作急性心功能障碍动物模型：术前以40mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠后，气管插管，将心电图电极固定在大鼠肢体上，实验过程中全程监测心电图。胸骨右侧第2肋间切口，分层打开胸腔，在主动脉根部钝性游离主动脉，将内径为0.8mm的注射器针头平行置于主动脉上，用4号手术丝线将主动脉和针头一同结扎，然后缓慢将针头撤出，关胸，分层缝合，青霉素抗感染，大鼠恢复自主呼吸后，拔出气管插管。 术后 1、2、4、6、8、10、12h 各取 5 只大鼠分别检测血流动力学指标，然后将大鼠断颈处死，取心血以及左室前壁心肌组织，心肌组织分为3部分，分别作免疫组织化学、Western印迹法、实时RT-PCR分析。另取5只大鼠作为对照组，仅麻醉、气管切开处理，不作开胸解剖。

模型成立后观察血流动力学参数，包括左室收缩压（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左室舒张末压（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）、左室内压最大上升速率+dp/dtmax、左室内压最大下降速率-dp/dtmax。

1.3.2 免疫组织化学染色

左室前壁心肌组织经4%多聚甲醛固定后，水洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制作厚度为5μm切片。BNP多克隆抗体以1∶600稀释，采用Elivision法进行免疫组织化学染色，苏木素复染细胞核，具体步骤按照试剂盒使用说明书进行，染色过程中另以抗体稀释液代替一抗，作为阴性对照。

1.3.3 Western印迹法检测

左室前壁心肌组织100 mg，加入组织-细胞裂解液，冰上匀浆，超声破碎，4℃下以离心半径9.35 cm，12 000 r/min，离心40 min。取上清液，BCA法进行蛋白定量，聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干转印法100 mA 90min 转移到 PVDF 膜上，一抗（1∶600）、二抗（1∶2000）孵育后，加入ECL发光剂进行化学发光。凝胶成像系统对PVDF膜进行成像，用Scion Image图像分析软件对所成像中蛋白条带光密度进行半定量分析。各组均以GAPDH为内参照。

1.3.4 实时RT-PCR检测

Trizol法提取心肌组织中总RNA，反转录为cDNA，PCR引物参照文献[5]进行合成，引物序列见表1。各组以GAPDH作为内参，实时RT-PCR结果由PRISM®7500 Real-Time PCR System自动采集计算出BNP基因的相对含量，以相对含量的变化来反映BNP mRNA的变化。

表1 实时RT-PCR引物序列

1.4 统计分析

采用SPSS 17.0软件进行统计分析，运用Oneway ANOVA进行组间分析，数据由±s表示。检验水准 α=0.05。

2 结 果

2.1 血流动力学参数

在实验过程中，1h组有3只大鼠、2～12h组各有2只大鼠死亡。

血流动力学参数见表2，就大鼠心脏质量与体质量比值（HW/BW）而言，除2h、10h组外，所有的实验组与对照组之间差异无统计学意义。与对照组相比，实验组大鼠的 LVSP、LVEDP、+dp/dtmax明显升高，-dp/dtmax4～12 h明显降低，差异具有统计学意义（表2），表明该模型造成了心室射血分数减少，成功导致了大鼠急性心功能障碍。

2.2 免疫组织化学染色结果（图1）

对照组大鼠多呈阴性染色。随着心功能障碍持续时间增加，实验组大鼠阳性着色不断增强：1～2h主要表现为弱阳性，部分心肌细胞胞浆内可见棕黄色颗粒状沉积物，周围的心肌细胞则呈阴性着色；4～6h心肌细胞主要表现为阳性，阳性细胞面积不断增大，偶可见阴性着色细胞；10～12h大鼠心肌细胞表现为强阳性，阴性细胞几乎不可见。另外，对同一张切片而言，心内膜侧的染色强度往往比心外膜侧强，从心内膜向心外膜染色强度逐渐减弱。

表2 血流动力学参数 （±s）

表2 血流动力学参数 （±s）

注：1）与对照组比较，P＜0.05

组别 n HW/BW/（mg/g） HR/（次/min） LVSP/mmHg LVEDP/mmHg +dp/dtmax/（mmHg/s） -dp/dtmax/（mmHg/s）对照 5 3.15±0.17 380±36 91.3±6.8 2.3±0.3 4327±172 4210±320 1h 2 3.82±0.53 470±54 152.7±7.21） 13.2±3.21） 6801±2471） 3817±282 2h 3 4.36±0.251） 376±23 170.4±7.81） 20.3±2.71） 7217±2611） 3904±274 4h 3 3.57±0.36 341±25 178.2±6.91） 23.2±2.51） 7632±2481） 3682±2411）6h 3 3.72±0.48 325±32 182.1±9.31） 25.8±3.71） 6482±2651） 2896±2631）8h 3 3.75±0.83 330±27 186.6±10.21） 28.9±3.41） 6570±2861） 2763±1831）10h 3 4.47±0.971） 305±20 175.3±8.71） 20.2±2.41） 4872±1621） 2409±1671）12h 3 3.85±0.74 360±38 169.7±7.51） 18.5±1.91） 4620±1571） 2382±1461）

图1 BNP免疫组织化学染色结果 Elivision×400

2.3 Western印迹法和实时RT-PCR结果

Western印迹法结果显示，随心功能障碍时间的持续，平均光密度呈升高趋势，最大比值出现在10h，12h 开始下降（图 2，表 3）。

实时RT-PCR结果显示，BNP mRNA较BNP蛋白变化时间提前。急性心功能障碍后1h，大鼠心肌组织中BNP mRNA含量即达到对照组的3.4倍左右，而且BNP mRNA含量在6 h达到峰值，比BNP蛋白达到峰值的时间提前4h。6h后BNP mRNA含量呈下降趋势（表3）。

图2 Western印迹法结果

表3 大鼠急性心功能障碍后各时间段BNP蛋白平均光密度和BNP mRNA相对表达量（±s）

表3 大鼠急性心功能障碍后各时间段BNP蛋白平均光密度和BNP mRNA相对表达量（±s）

注：1）与对照组相比，P＜0.05；2）与相邻上组相比，P＜0.05

组别 n 平均光密度 mRNA相对表达量对照 5 3.17±0.62 1 1h 2 21.60±1.241） 3.42±0.231）2h 3 42.38±1.721）2） 3.86±0.391）4h 3 55.04±2.191） 5.56±0.271）2）6h 3 61.70±2.981） 6.19±0.491）8h 3 83.92±3.281） 5.82±0.511）10h 3 95.71±2.761） 5.64±0.821）12h 3 75.30±2.971） 4.72±0.501）2）

2.4 心律失常致死大鼠心肌中BNP的表达

实验过程中心电图监测结果显示，心律失常是实验过程中大鼠死亡的主要原因，尤以室性心律失常为主。对这类死亡大鼠心肌组织中BNP的研究发现，除BNP mRNA较对照组明显升高外，免疫组化染色结果和Western印迹法结果与对照组相比均没有明显差异。

3 讨 论

BNP是心室容量负荷和压力负荷增大时心肌细胞释放的一种激素，机械性牵张是心肌细胞合成和分泌BNP的主要机制[6]。临床研究[7]表明，血浆中BNP浓度与心室射血分数具有相关性，心室射血分数不足时，有效循环血量不足，大量的血液聚集在心室内，导致心室压力增大心室腔扩张，从而引起BNP合成和释放。因此，BNP是心脏容量负荷和压力负荷增大的直接产物，任何因素导致心功能障碍、射血分数低下，都会导致BNP合成和释放增加，死后检测BNP极有可能反映死亡之前的心功能状态。特别对于没有明显心肌缺血或者梗死的案例，死后检测BNP能较客观地反映死前的心功能障碍存在，在法医学上有重要的意义[8]。本实验表明大鼠主动脉缩窄后，血流动力学指标包括LVSP、LVEDP、+dp/dtmax都明显升高，表明心脏射血分数明显减小，心功能障碍模型建立。免疫组织化学染色结果显示，实验组大鼠随着心功能障碍持续时间的延长，染色强度从心内膜向心外膜逐渐减弱，对照组染色结果为阴性。2h内的染色以弱阳性为主，6h以后逐渐增强，呈阳性和强阳性，进一步证实了BNP是反映心脏血流动力学负荷增大时的应急和敏感指标[9]，可见心功能障碍可以通过BNP的免疫组织化学染色显示出来，染色强度能反映心功能障碍的持续时间。BNP蛋白定量检测结果显示，心肌组织中BNP浓度与心功能障碍持续时间有良好的相关性。

为探索早期BNP基因的表达，本研究同时也检测了BNP mRNA的含量变化。结果表明急性心功能障碍后1h即能检测到BNP mRNA显著升高。关于大鼠急性心肌梗死模型中心肌组织BNP的表达规律早有报道。徐永城等[10]的研究表明，结扎左冠状动脉前降支3h后，心肌组织中BNP mRNA才开始升高；Hama等[11]发现，阻断心肌血流4 h后，左心室心肌中BNP mRNA的浓度明显高于对照组。与先前的研究结果不同，本研究大鼠急性心功能障碍模型中，手术后1 h即能检测到明显的BNP mRNA升高，比上述实验结果时间要早。另外，心功能处于代偿期的时候，并不会引起BNP基因表达的上调，只有处于失代偿性心功能障碍时BNP基因的表达才会增加，表明BNP是心功能从代偿期到失代偿期过渡的标志物[12]，所以完全可以解释为何心肌梗死3～4 h后才能检测到BNP mRNA明显升高这一结果。考虑到正常心肌组织中基本没有或者只含有少量的BNP蛋白和mRNA，只有心肌细胞存在机械性牵拉时才会刺激BNP的合成和分泌，故BNP mRNA是急性心功能障碍时心室容量负荷和压力负荷增大，心室壁牵张信息的储存体，尤其当濒死期很短时，BNP蛋白尚未合成和分泌，此时BNP mRNA的检测将有助于解释死亡时的微观病理生理过程[13]。

研究心功能障碍时BNP的表达规律对一些由缺血性心脏病导致心源性猝死的认定有一定的意义。在这些猝死的案件中，系统的法医学解剖往往检测不到急性心肌梗死或者明显的冠状动脉狭窄或者冠状动脉血栓形成，其中有一些冠状动脉病变很轻微，冠状动脉狭窄不超过Ⅱ级；而且在一些高度怀疑为缺血性心脏病致死的案件中，即使使用实时RT-PCR检测技术都找不到明显的缺血性损伤的证据[14]。就急性心肌缺血而言，笔者认为，单纯依据尸检时检测到轻微或局部的缺血性改变不足以准确阐明猝死的确切机制和病理生理过程；急性心肌缺血往往只有引起急性心律失常或者严重影响心室射血功能时才可能导致猝死，因此，在得出缺血性心脏病导致猝死的鉴定结论之前有必要客观评价死亡之前的心功能状态，结合本研究结果可以推测检测心肌组织中BNP的表达情况对此类案件的诊断具有一定的参考价值。

另外，临床研究[15-16]表明，心律失常，尤其是室性心律失常（ventricular arrhythmias，VA）是心源性猝死的主要致死原因。本实验心电图检测结果表明，心功能障碍时常伴有各种心律失常发生，主要表现为室性心动过速和室颤，且心律失常死亡大鼠BNP mRNA明显升高。心律失常发生时往往导致心室射血分数（ejection fraction，EF）降低，有效循环血量不足，心室过度充盈扩张，必然导致心肌细胞合成和释放BNP增加。很多研究[17-20]均表明BNP是预测住院病人发生心律失常及预后和死亡率的强有力的指标，可见心肌组织中BNP与心律失常可能有密切的关系。

本研究结果表明，增加左心室后负荷造成急性心功能障碍后大鼠心肌组织中BNP、BNP mRNA的表达明显升高，且具有一定的时间规律性。检测心肌组织中BNP蛋白及BNP mRNA的表达可为法医病理学者客观评价心功能状态提供一种新的途径。

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