工艺条件对发芽糙米中γ-氨基丁酸含量的影响

马 涛，陈伟玲

（1.渤海大学化学化工与食品安全学院，辽宁锦州121013；2.沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳110866）

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

稻米品种 辽星1号，辽宁省沈阳中稻股份有限公司提供；pH=9.0的硼酸缓冲液、6g/100mL重蒸苯酚溶液、60%乙醇溶液、10%次氯酸钠 济南鸿鑫化工有限公司；γ-氨基丁酸 SIGMA公司。

HH.B11-500电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂；HH-601A超级恒温水浴锅 江苏省金坛市医疗仪器厂；SC-279GA海尔冰柜；UV1200紫外可见分光光度计 上海正慧工贸有限公司；PB-20标准pH计、1245电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；SD-A砻谷机 辽宁省沈阳农业大学水稻研究所；3mm米筛 浙江上虞市五四纱筛厂。

1.2 方法与步骤

1.2.1 糙米发芽 砻谷→谷糙分离→筛选→精选→清洗→浸泡→培养→沥干→检验→烘干→成品发芽糙米

1.2.1.1 糙米的制备及筛选 用实验用的小型砻谷机将稻谷砻壳后得到糙米，用3目的标准不锈钢筛子过筛，得到整米率约为98%的含胚糙米。

1.2.1.2 糙米的人工精选去杂 去除霉变、异色、虫蛀粒、未成熟粒、无胚米及石头等杂质。

1.2.1.3 称样 称取糙米样品20份，每份30g。用于分析糙米发芽的温度和时间与γ-氨基丁酸含量的关系。

1.2.1.4 糙米的清洗 先用自来水冲洗3遍，洗去表面的糠粉和灰尘，沥干后，再用纯净水冲洗3遍。

④中枢神经系统疾病：老年痴呆(Alzheimer's disease,AD)、帕金森病(Parkinson's disease,PD)等神经退行性病变；

1.2.1.5 糙米的浸泡与萌芽 将事先称好的样品30份，每份30g，用细尼龙网包好，设6份为一组，共五组，分别放在24、27、30、33、36℃的恒温水浴中浸泡，浸泡0、3、6、9、12、15h时，从每组中取出一份进行培养。将浸泡过的糙米放入垫有两层滤纸的发芽皿中，置于相对湿度为95%的恒温恒湿培养箱中催芽，设定培养温度与浸泡时的温度相一致。

1.2.1.6 取样 培养0、2、4、6、8、10、12h时分别取样。

1.2.2 γ-氨基丁酸含量的测定 采用比色法。取部分发芽糙米沥干，称量2.5g，加适量蒸馏水研磨匀浆，然后定容至50mL于30℃水浴锅中浸提2h。过滤后取上清夜0.5mL，加入0.2mL硼酸缓冲溶液（pH9.0），1mL浓度为6g/100mL的重蒸苯酚溶液，0.4mL有效氯含量10%的次氯酸钠溶液，充分振荡，置于沸水浴10min，再立即冰浴20min，并不断振荡，待出现蓝绿色后加入2mL体积分数60%的乙醇溶液，再次振荡均匀，静置后于645nm波长处测定其吸光度[5]。

1.2.3 单因素实验 在实验过程中分别考察了浸泡时间（0、3、6、9、12、15h）、培养时间（0、4、8、12、16、20、24h）和发芽温度（24、27、30、33、36℃）对发芽效果的影响，以糙米发芽过程中γ-氨基丁酸含量为评定指标。

1.2.4 响应面实验设计 根据单因素实验确定各因素的取值水平范围，结合Box-Benhnken的中心组合实验设计原理[6-11]，分别选取浸泡时间（A）、培养时间（B）、发芽温度（C）作为自变量，每个因素取三个水平（-1、0、1），以芽糙米的γ-氨基丁酸含量作为响应值，设计响应面实验。响应面因素水平编码表如表1所示。

表1 Box-Behnken的中心组合设计因素和水平表Table 1 Factors and levels in Box-Behnken of response surface experiment

2 结果与分析

2.1 γ-氨基丁酸标准曲线的绘制

取准确配制好的0、20、40、60、80、100μg/mL的γ-氨基丁酸标准溶液，按照1.2.2的方法测定其吸光度。

以浓度为横坐标（x），吸光度为纵坐标（y），绘制标准曲线曲线，得回归方程为：

y=0.0052x-0.0057，R2=0.9993，如图1所示。

图1 γ-氨基丁酸的标准曲线Fig.1 Standard curve of γ-aminobutyric acid

2.2 单因素实验

2.2.1 浸泡时间对发芽糙米中γ-氨基丁酸含量的影响 设定培养时间为16h，发芽温度为27℃，不同浸泡时间对发芽糙米中γ-氨基丁酸含量的影响如图2所示。

图2 浸泡时间对γ-氨基丁酸含量的影响Fig.2 Effects of soaking time on the content of γ-aminobutyric acid

如图2所示，γ-氨基丁酸含量随浸泡时间的增大而升高，浸泡9h时，γ-氨基丁酸的含量达到最高，随着浸泡时间继续延长，γ-氨基丁酸含量又逐渐降低。在浸泡9h之前，糙米处于吸水、溶胀阶段，随着水分的增加，酶在溶液中的溶解性越大，谷氨酸在谷氨酸脱羧酶作用下生成γ-氨基丁酸，γ-氨基丁酸的含量呈增长趋势。浸泡时间超过9h后，大部分谷氨酸物质已经转化为γ-氨基丁酸，营养物质也被消耗部分，由于发芽的需要，已生成的γ-氨基丁酸也会被水解，生成率小于水解率，含量会随着浸泡时间的增大而降低。培养时间、发芽温度一定的条件下，γ-氨基丁酸含量最佳的浸泡时间是9h。

2.2.2 发芽温度对发芽糙米中γ-氨基丁酸含量的影响 设定浸泡时间为9h，培养时间为16h，发芽温度对发芽糙米中γ-氨基丁酸含量的影响如图3所示。

表2 响应面设计实验结果Table 2 Response surface test results

图3 发芽温度对γ-氨基丁酸含量的影响Fig.3 Effects of germination temperature on the content of γ-aminobutyric acid

如图3所示，发芽温度由24℃增到27℃时，γ-氨基丁酸含量呈增长趋势；温度高于27℃，随着发芽温度继续升高，γ-氨基丁酸含量呈下降趋势。温度越高，吸水越快，糙米萌芽越快，因为温度适当时会促进γ-氨基丁酸的增长；当温度过高时，在浸泡的时候吸水就过快，可能会破坏细胞的结构，导致营养物质流失，生成γ-氨基丁酸的底物减少，导致γ-氨基丁酸含量降低。浸泡时间、培养时间一定的条件下，γ-氨基丁酸含量最佳的发芽温度是27℃。

2.2.3 培养时间对糙米发芽中γ-氨基丁酸含量的影响 设定浸泡时间为9h，发芽温度为27℃，培养时间对发芽糙米中γ-氨基丁酸含量的影响如图4所示。

图4 培养时间对γ-氨基丁酸含量的影响Fig.4 Effect of culture time on the content of γ-aminobutyric acid

如图4所示，在浸泡后的培养过程中，随着培养时间的延长，γ-氨基丁酸含量升高，培养到16h时达到最高值；培养时间继续延长，γ-氨基丁酸含量逐渐降低。浸泡时间、发芽温度一定的条件下，γ-氨基丁酸含量最佳的培养时间是16h。

2.3 响应面法确定发芽糙米中γ-氨基丁酸含量最佳条件

2.3.1 响应面模型建立及显著性分析 响应面设计实验结果见表2。利用Minitab 15软件的Box-Behnken程序对实验结果进行响应面分析，经二次回归拟合后，得出回归模型参数估计值、方差分析，结果见表3～表4。

表3 响应面回归方程建立Table 3 Response surface regression for the establishment of equation

从表3可以得到各因素影响程度为：培养时间的影响极显著（p＜0.001），发芽温度的影响显著（p=0.031），浸泡时间的影响不显著（p=0.500）。浸泡时间、培养时间、发芽温度的二次项都对γ-氨基丁酸含量的影响极显著，p值都小于0.001；浸泡时间与培养时间的交互作用（p＜0.001）、浸泡时间与发芽温度的交互作用（p=0.002）都对γ-氨基丁酸含量的影响极显著。

拟合后得到以γ-氨基丁酸含量为目标函数的二次多项回归模型为：Y=232.1333-0.50000A-20.46250B+2.03750C-32.10417A2-31.47917B2-69.57917C2-11.15000AB-6.10000AC+1.02500BC。

方程中各项系数的绝对值直接反映了各因素对γ-氨基丁酸含量的影响程度，系数的正负反映了影响的方向。

表4 回归模型方差分析Table 4 Analysis of variance for second-order polynomial model fitted to the response variable

表4可知，用上述回归方程描述各因素与响应值之间的关系时，此模型的p＜0.01，表明响应回归方程达到了极显著水平，相关系数R2＝0.9892，表明98.92%的数据可以用此方程来解释，因而该模型拟合程度良好。实验误差小，适合发芽糙米中γ-氨基丁酸含量进行分析和预测。从模型的失拟性方差分析可以看出，失拟项不显著（p=0.067＞0.05），表明该模型稳定，能很好的预测γ-氨基丁酸含量的变化，使用该方程模拟真实的3因素3水平分析可行。

2.3.2 响应面图分析 利用Design Expert 7.0软件对二次回归模型进行规范分析，浸泡时间、培养时间、发芽温度之间交互作用对灭菌率的影响见图5～图7。

响应曲面图可以反映出因素之间交互效应的强弱[11]，由图5～图7可以看出，浸泡时间与培养时间、发芽温度之间的交互作用极显著，而培养时间与发芽温度之间的交互作用不显著。由图5可见，根据回归分析方程在考察的区域内绘制的响应面图发生弯曲，说明了因素A、C对Y是非线性的，存在二次项。随着浸泡时间和培养时间的提高，Y值也在增大，当浸泡时间和培养时间升高到一定程度时，Y值达到最大；当浸泡时间和培养时间继续升高时，Y值又会随之下降，说明它们取某个适中值时，可使Y值达到最大。同理，从图5、图6可以看出，A、C，B、C同样对Y的影响是非线性的，存在二次项。可以通过软件优化、模拟得最佳提取条件。

图5 Y=f（A，B）响应面图Fig.5 Response surface of the effects of A and B on the content of γ-aminobutyric acid

图6 Y=f（A，C）响应面图Fig.6 Response surface of the effects of A and C on the content of γ-aminobutyric acid

图7 Y=f（B，C）响应面图Fig.7 Response surface of the effects of B and C on the content of γ-aminobutyric acid

2.3.3 最佳条件的确立与检验 为了进一步验证最佳点的值，对回归方程取一阶偏导解得A、B、C的编码值为：A=0.110045、B=-0.430672、C=0.041280。利用编码公式xi=（Xi-X0）/△X对自变量进行求解，其中xi为自变量的编码值，Xi为自变量的真实值，X0为实验中心点处自变量的真实值，△X为自变量的变化步长。因此可以根据编码公式求出自变量A、B、C的预测值为：A=9.330135，B=14.277313，C=27.123841，即浸泡时间为9.330135h，培养时间为14.277313h，发芽温度为27.123841℃；γ-氨基丁酸含量预测值为233.601737mg/100g，近似为233.6mg/100g。为检验响应面的可靠性，在最佳灭菌条件下进行验证实验，考虑到实际操作可行性，将最佳条件修订为：浸泡时间为9.3h、培养时间为14.3h、发芽温度为27℃。此条件下进行平行实验，γ-氨基丁酸平均含量达到232.8mg/100g，表明实际测量值接近预测值，说明该模型是合理有效的具有一定的实际指导意义。

3 结论

根据单因素以及响应面实验，得到了糙米发芽时各因素变量对γ-氨基丁酸含量的回归方程，该模型回归显著，对实验拟合良好，具有一定的应用价值，并得到γ-氨基丁酸含量最佳条件：浸泡时间为9.3h，培养时间为14.3h，发芽温度为27℃，最佳的γ-氨基丁酸含量为232.8mg/100g。因此，通过响应面发对糙米发芽过程中含量进行优化，可获得最佳γ-氨基丁酸发芽工艺条件，从而为进一步实验提供基础。

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