黄连生物碱对线粒体复合物Ⅲ蛋白表达的影响

刘旭晶，叶小利，高 英，易 骏，李小多，李学刚，*

（1.西南大学药学院，重庆北碚400716；2.西南大学生命科学学院，重庆北碚400715；3.旺苍县农业局，四川旺苍县 628200）

糖尿病（Diabetes mellitus，DM）是一种由多种因素诱发导致体内糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合症[1]，糖尿病一旦控制不好会引发并发症，导致肾、眼、足等部位的衰竭病变。黄连为毛茛科植物，药食两用，其有效成分包括小檗碱、黄连碱、药根碱、表小檗碱、巴马汀，其作为一味传统中药用于清热燥湿、泻火解毒。黄连治疗“消渴”（中医称糖尿病为“消渴”症）最早见于《名医别录》（成书于约公元220～450年），有黄连“主五脏冷热，……止消渴”的记载；《新修本草》（成书于公元659年）称其“味极浓苦，疗渴为最”。黄连治疗糖尿病不仅历史悠久，且效果显著。长期以来，黄连作为中医治疗“消渴”病的常用药物而一直被广泛应用于临床。现代国内外有大量文献报道，黄连生物碱能有效治疗糖尿病及其并发症[2-4]，因此，黄连治疗糖尿病不仅历史悠久，而且效果显著。糖类的代谢主要是在细胞内线粒体呼吸链中进行的，这一过程涉及五种线粒体复合物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ）[5]，为进一步探索黄连生物碱的降血糖靶点，本实验以HepG2细胞为模型，建立HPLC方法观察细胞对五种黄连生物碱的吸收及其进入细胞后对线粒体复合物Ⅲ表达的影响。目前，用HPLC法检测细胞内生物碱含量以及以线粒体复合物Ⅲ为靶点研究降血糖尚未见报道，因此本研究结果为黄连降血糖的研究及相关产品开发利用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

肝癌细胞株QGY-7703 购买于重庆医科大学肝脏病研究所；黄连碱、小檗碱、药根碱、表小檗碱、巴马汀 均由本实验室制备[6]；色谱级乙腈（ACN）、胰酶 美国Sigma公司；磷酸（H3PO4）、盐酸（HCl）、丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、过硫酸铵（APS）、四甲基乙二胺（TEMED）及十二烷基磺酸钠（SDS）成都科龙试剂公司；血清 杭州四季青生物工程材料有限公司；RPMI1640培养基 上海酶联生物科技有限公司；RIPA强裂解液 碧云天公司；鼠抗人线粒体复合物Ⅲ抗体（ab 14745） 购买于英国Abcam公司；兔抗鼠辣根过氧化物酶标记Ⅱ抗 美国Sigma公司；脱脂奶粉 德国AppliChem公司；去离子水。

X胶片 美国柯达公司；Beckman L7型超高速冷冻离心机 美国Beckman公司；CO2培养箱，LC-20A型高效液相色谱仪 日本岛津公司；DYCZ-24DN双垂直电泳槽、DYCZ-40D转移电泳槽 杭州汇尔仪器公司；硝酸纤维素膜 北京鼎国生物技术发展中心。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 将复苏的肝癌细胞株置于含青霉素和链霉素（100μg/mL），血清10%的RPMI1640培养基中，5%的CO2，37℃，饱和湿度条件下的六孔板中培养。

1.2.2 HPLC检测细胞中黄连生物碱含量

1.2.2.1 样品制备 分别称取五种生物碱各0.01g，相互混合后溶于10mL一级水中，分别与无血清培养基混合，使培养液中每种生物碱终浓度分别为：0.25、0.50、1.00、2.00、4.00μg/mL。细胞培养24h后，培养基换成含生物碱混合的无血清培养基和空白对照组（即为不含黄连生物碱的无血清培养基），再培养24h。待培养完成后，培养液中生物碱的真实含量用HPLC检测。用PBS缓冲溶液冲洗细胞5次，最后一次清洗后的缓冲液用HPLC检测其中生物碱含量。每个孔中加入1.50mL RIPA强裂解液，静置5min，取混合液离心，20000g，30min，取上清液浓缩10倍（此时上清液中生物碱浓度为C浓缩）。

1.2.2.2 色谱条件 色谱柱：Hypersil ODS2（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-0.05mol/L KH2PO4溶液（50∶50）（每100mL加0.2g SDS）；流速：1mL/min；进样量：20μL；柱温：30℃；检测波长：345nm。

1.2.2.3 HepG2细胞内生物碱吸收量的计算 通过HPLC检测出来的生物碱浓度即为C浓缩，通过式（1）计算得到细胞内生物碱的真实浓度：

式中：C胞内—细胞内生物碱的真实浓度（μg/mL）；C浓缩—经过HPLC所测得的生物碱浓度（μg/mL）；V强裂解液—加入的强裂解液的体积（mL）；S孔—六孔板中每个孔的底面积（cm2）；D细胞—HepG2细胞的平均直径（μm）；10—上清液稀释倍数。

1.2.3 Western blot检测细胞中线粒体复合物Ⅲ的含量

1.2.3.1 细胞的裂解及蛋白质样品的制备 细胞培养24h后，培养基换成含不同浓度的一种生物碱的无血清培养基（黄连碱终浓度：0.02、0.10、0.50、2.00μg/mL，小檗碱、表小檗碱、巴马汀组亦如此，因在上一步实验的细胞中未能检测到药根碱，故此处不再对其进行检测）和空白对照组（即为不含黄连生物碱的无血清培养基），继续培养24h。用PBS缓冲溶液冲洗细胞1次，用滤纸吸去剩余水分，每个孔中加入0.50mL RIPA强裂解液，在摇床中冰浴条件下振荡1h，取混合溶液与蛋白加样缓冲液（2∶1）混匀，在100℃条件下加热10min变性。

1.2.3.2 蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳 取40μL上述溶液，在恒流25mA条件下，12%SDS-PAGE凝胶电泳，至溴酚蓝染色接近胶底边后停止电泳。

1.2.3.3 蛋白质转膜 电泳后将凝胶中的蛋白质湿法电转移至硝酸纤维素膜上。

1.2.3.4 孵育Ⅰ抗和Ⅱ抗 转膜后，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭硝酸纤维素膜1h。Ⅰ抗用TBST按1∶1000稀释，将Ⅰ抗与膜封闭在塑料袋中于摇床中4℃过夜。后用TBST洗膜3次，每次15min，用ECL增强发光剂显色后，置暗室曝光于X胶片，曝光时间为20min，常规显影，定影。膜再与辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠Ⅱ抗（按1∶8000稀释）室温孵育2h，重复上述步骤。

1.2.3.5 胶片分析处理 应用Quantity One软件对条带进行灰度分析处理。目的条带与β-actin条带灰度比值，表示样本表达强度。

2 结果与分析

2.1 HepG2细胞对五种不同生物碱的吸收量

培养完成后，将培养液收集，用HPLC检测此时培养液中生物碱的真实含量（见表1），以反映在培养过程中生物碱含量的变化：五种生物碱的浓度在经过24h培养后仅发生微小的变化，这种变化与细胞的吸收、生物碱自身的氧化分解及培养液的挥发等有关。经HPLC检测出来的裂解液中生物碱浓度通过式（1）换算得到细胞内生物碱的真实浓度（见表2）。

图1 培养液中小檗碱浓度与细胞内小檗碱浓度的关系Fig.1 The relationship of berberine between in the cultural and in the cellular

结果显示，在细胞内检测不到药根碱，说明HepG2细胞对药根碱不吸收；在生物碱浓度相同条件下，细胞对其余四种生物碱吸收量：小檗碱＞黄连碱＞表小檗碱＞巴马汀，其中培养液中黄连碱和小檗碱浓度与细胞内的生物碱浓度呈良好线性关系（见图1、图2）。

表1 培养完成后培养液中黄连生物碱的含量Table 1 The concentration of alkaloids in cell culture fluid after culture

表2 细胞内生物碱浓度Table 2 Concentration of alkaloids in cellular

图2 培养液中黄连碱浓度与细胞内黄连碱浓度的关系Fig.2 The relationship of coptisine between in the cultural fluid and in the cellular

2.2 生物碱对线粒体复合物Ⅲ表达的影响

提取的HepG2细胞内蛋白经SDS-PAGE后转膜，分别以鼠抗人ab14745抗体为Ⅰ抗进行Western blot，检测到反映条带位于49.5ku处，内参β-actin反应条带位于43ku处，不同生物碱对应的反映条带着色不一（见图3），黄连碱和小檗碱的条带颜色较深。

对反应条带用Quantity One软件处理后，结果如图4所示。实验结果表明，4种生物碱中只有小檗碱和黄连碱能明显提高线粒体复合物Ⅲ的表达，且在相同浓度下，小檗碱的效果高于黄连碱，且小檗碱在低浓度时效果更明显；表小檗碱浓度的变化，对目的蛋白的表达几乎无影响；巴马汀组在低浓度时甚至出现抑制目的蛋白表达的现象，但随着浓度的增加，作用也随之减弱。通过HPLC和Western blot实验可以证明，在相同浓度下，HepG2细胞能够选择性吸收这五种生物碱，小檗碱最易于吸收，黄连碱次之，而对药根碱不吸收；待生物碱进入细胞后，小檗碱对线粒体复合物Ⅲ的调控作用最强，黄连碱次之，其他两种碱则几乎没影响。

图3 4种生物碱对应的线粒体复合物Ⅲ蛋白含量Fig.3 The content of Mitochondrial ComplexⅢthat correspond to four alkaloids

图4 4种生物碱对线粒体复合物Ⅲ蛋白表达的影响Fig.4 The effect of four alkaloids on the expression of Mitochondrial ComplexⅢ

3 结论与讨论

目前，关于黄连及其生物碱治疗糖尿病及其并发症的作用机制主要体现在以下几个方面：a.改善葡萄糖代谢；b.对炎症因子的影响；c.抗氧化，清除自由基（ROS）；d.改善脂质代谢[7]。糖类的代谢主要是在线粒体呼吸链中进行的，在这一过程中糖被代谢产生大量的活性氧（ROS），而细胞内过量的ROS正是造成糖尿病并发症的罪魁祸首[8-9]，过量的ROS会攻击细胞内蛋白、膜脂、核酸等重要生命活动所需的分子，造成细胞功能的障碍，严重时可引起细胞的凋亡，进而造成眼病、肾病、足病等并发症。Raha教授[10]发现线粒体复合物Ⅲ在ROS的产生中起到至关重要的作用，当用抗霉素A抑制复合物Ⅲ的表达时，细胞内产生大量的ROS，当复合物Ⅲ被刺激促进表达时，ROS的含量也受到抑制。

目前对黄连生物碱以线粒体复合物Ⅲ为靶点研究其降血糖功能的研究尚未见报道。在本实验中，首次建立以HPLC方法检测HepG2细胞对黄连生物碱的吸收，之后用Western blot测定生物碱对线粒体复合物Ⅲ表达的影响。实验结果表明，黄连中的小檗碱和黄连碱能更多地被细胞所吸收和利用，提高线粒体复合物Ⅲ的表达，从而抑制胞内产生过多的ROS，清除自由基，保护谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）等清除自由基的酶类的活性，抑制糖尿病并发症的出现，从而提高糖尿病患者的生活质量。

[1]陈吉生，郑聪.中药治疗糖尿病及其并发症的应用分析[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（23）：276-279.

[2]Turner N Li，J Y Gosby，A To SWC，et al.Berberine and its more biologically available derivative，dihydroberberine，inhibit mitochondrial respiratory complex I[J].Diabetes，2008，57（5）：1414-1428.

[3]Yin J，GaoZ，Liu D，et al.Berberine improves glucose metabolism through induction of glycolysis[J].American Journal of Physiology-Endocrinology And Metabolism，2008，294（1）：148-156.

[4]Xia X，Yan J，Shen Y，et al.Berberine improves glucose metabolism in diabetic rats by inhibition of hepatic gluconeogenesis[J].Plos One，2011，6（2）：16556.

[5]Raha S，Robinson BH.Mitochondria，oxygen free radicals，disease and ageing[J].Trends in Biochemical Sciences，2000，25（10）：502.

[6]Chen Hong-Ying，Ye Xiao-Li，CX-L，et al.Cytotoxicity and antihyperglycemic effect of minor constituents from Rhizoma Coptis in HepG2 cells[J].Fitoterapia，2012，83：67-73.

[7]安小平，崔庆荣.黄连治疗糖尿病的研究进展[J].甘肃中医，2008，21（1）：57-58.

[8]Brownlee M.Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications[J].Nature，2001，414：813-820.

[9]Vincent AM，Callaghan BC，Smith AL，et al.Diabetic neuropathy：cellular mechanisms as therapeutic targets[J].Nature Reviews Neurology，2011，7（10）：573-583.

[10]Raha S，McEachern GE，Myint AT，et al.Superoxides from mitochondrial complex III：the role of manganese superoxide dismutase[J].Free Radical Biology and Medicine，2000，29（2）：170-180.