大鼠急性肠缺血模型中血清肠脂肪酸结合蛋白和D-乳酸浓度与缺血时间和肠组织损伤的相关性

石 卉, 吴本俨, 王昌正, 王卫华, 刘文徽

（解放军总医院南楼临床部消化内科, 北京 100853）

急性肠缺血（acute mesenteric ischemia，AMI）时由于急性的肠壁动脉血供不足或静脉回流障碍，从而引起肠壁的营养障碍或运动障碍，其主要并发症为肠管节段性坏死[1]。该病起病急骤，早期症状、体征不典型，误诊率及病死率较高，尚缺少特异性生物标志物[2]，当出现明显的腹膜炎体征以及特异性影像学表现时，病情往往已经进入晚期，其临床表现为肠管坏死、中毒性休克、多器官功能衰竭等，严重危及患者生命。尽管其在诊断技术和治疗方法已有一些进展，但急性肠缺血的死亡率仍高达60%～80%[2]，误诊率达80%～95%[3]。本研究旨在探索大鼠急性肠缺血模型血清肠脂肪酸结合蛋白（intestinal fatty acid binding protein，I-FABP）和D-乳酸（D-lactate，D-Lac）浓度与缺血时间、肠黏膜损伤的相关性，以期为急性肠缺血早期血清标志物提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

抗I-FABP单克隆抗体（Sigma公司，美国），D-Lac测定试剂盒（嘉美生物，中国），ELISA免疫试剂盒（Cayman chemical，美国），酶标仪（DENLEY DRAGON Wellscan MK 3，芬兰），分析软件（Ascent software for Multiskan），离心机（TGL-168）。

1.2 实验动物和分组

健康成年雄性Wistar大鼠60只（250～300g），购于解放军总医院动物实验中心。标准饲料饲养，大鼠自由摄食和饮水。在进行实验前，大鼠最少饲养1周以适应实验室环境。采用随机数字表法，将大鼠随机分为6组：假手术组（空白对照）、缺血30min组、缺血60min组、缺血90min组、缺血120min组、缺血150min组，每组10只。

1.3 动物造模

手术前实验动物禁食24h，自由饮水。手术当日，大鼠称重后，10%水合氯醛（5mg/kg）腹腔注射麻醉。麻醉成功后，大鼠取背卧位固定于解剖垫，腹部手术区备皮，碘伏消毒。取腹部正中切口，长3～4cm，逐层剪开腹壁各层进入腹腔。将小肠向左侧外置于温生理盐水浸湿的无菌纱布垫上，显露肠系膜前动脉，在其主动脉起源处向远端钝性分离出1～2cm，靠近其根部用一个无创性微血管夹夹闭肠系膜前动脉，阻断血流，观察肠系膜区无血管搏动，肠色泽变苍白，肠蠕动消失从而确认肠缺血诱导完成。假手术组仅开腹，显露肠系膜前动脉，不进行缺血处理。之后，将外置的小肠还纳腹腔，用两把小血管钳夹闭腹膜暂时关腹。同时右侧股静脉插管至下腔静脉，用于持续输液[生理盐水5ml/（kg·h）]。根据分组既定时间，打开腹腔，经腹主动脉抽血7～10ml，截取自幽门向下小肠组织约15cm，按上、中、下各5cm分瓶放入10%中性缓冲福尔马林溶液固定，大鼠开放性气胸致死，手术完毕。实验期间，用加热灯照射手术区以维持大鼠体温恒定，所有大鼠肠系膜前动脉阻断后给予生理盐水50ml/kg皮下注射以扩容抗休克，手术操作遵循无菌术原则。

1.4 实验标本预处理

1.4.1 血清标本制备及测定 各组动物实验终点，通过腹主动脉穿刺采集全血样本7～10ml，采血时注意防止溶血。37℃静置20min使血液凝固，低温离心机4℃ 2000转/min离心20min分离血清，取上清液3～5ml于-80℃保存备用。依据ELISA试剂盒说明书测定标本中I-FABP和D-Lac的浓度。

1.4.2 肠组织标本损伤评分 各组实验终点，动物处死前，截取自幽门向下小肠组织约15cm，按上、中、下各5cm分段，迅速用冷生理盐水溶液冲洗，清除黏液、污物等肠腔内容物后，立即分瓶置入10%中性缓冲福尔马林溶液，固定后石蜡包埋。依据Park/Chiu肠组织损伤评级系统，进行半定量的肠组织病理学评级。采用Kurt等[4]的评分系统：0级，正常组织黏膜；1级，上皮表面受损，肠绒毛尖端上皮下间隙轻度增大；2级，黏膜局灶溃疡，上皮层从固有层消失或上皮下间隙增大程度中等以上；3级，局灶透壁性溃疡，部分绒毛消失或大量上皮层消失；4级，大面积透壁性溃疡，大量绒毛消失，毛细血管暴露扩张；5级，大面积透壁性溃疡、出血，固有层中断。

1.5 统计学处理

所用统计学描述和分析均在SPSS17.0统计包上进行。计量资料以±s表示。生化指标分析采用单因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA）及Student-Newman-Keuls post-hoc analysis评价各分组之间的差异。对于组织病理学评级，组间差异的比较采用Kruscal-Wallis检验及Mann-Whitney U检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各缺血时间组血清I-FABP和D-Lac浓度测定

各组血清I-FABP和D-Lac浓度的变化如表1所示。缺血30min时血清I-FABP浓度即开始升高，缺血90min血清I-FABP浓度达到峰值（P＜0.05），其后随着缺血时间的延长，I-FABP浓度逐渐下降。缺血60min时D-Lac开始升高，随缺血时间延长，D-Lac浓度升高越明显（P＜0.05）。

表1 各组血清I-FABP和D-Lac浓度的变化Table 1 Serum I-FABP and D-Lac concentration in rats of each group (n＝10,±s)

表1 各组血清I-FABP和D-Lac浓度的变化Table 1 Serum I-FABP and D-Lac concentration in rats of each group (n＝10,±s)

I-FABP: intestinal fatty acid binding protein; D-Lac: D-lactate.Compared with sham-operation group, *P＜0.05

Group D-Lac(ng/L) I-FABP(mg/L)Sham-operation group 0.72±0.18 22.62±5.33 Mesenteric ischemia group 30min 0.97±0.15 713.28±68.43*60min 1.53±0.16* 1227.61±197.28*90min 2.76±0.35* 1741.37±184.12*120min 3.62±0.31* 1372.17±151.71*150min 5.81±0.28* 1096.74±163.82*

2.2 I-FABP 免疫组化结果

经I-FABP抗体以及DAB染色后，正常小鼠肠黏膜镜下染色阳性率为9.2%，缺血90min组，镜下染色阳性总个数、阳性总面积以及阳性率均为最高（平均72.5%；图1），缺血120min组镜下阳性率平均61.2%，缺血150min组镜下阳性率平均值为44.8%。

图1 缺血90min时I-FABP染色结果(阳性率最高达72.5%)Figure 1 Immunohistochemical staining of I-FABP at 90min with positivity rate of 72.5% (DAB ×400)

2.3 小肠黏膜损伤评分统计

假手术组小肠壁柔软温暖，系膜动脉搏动有力，色泽正常，蠕动均匀，约8次/min。其余各组缺血早期，可观察到小肠、盲肠和部分结肠色泽苍白，肠管痉挛变细，蠕动明显增快，约12次/min。随着缺血时间延长，缺血150min时，肠管无蠕动，肠壁颜色发黑，温度明显降低，但未见肠管穿孔。具体评分如表2所示。结果提示缺血时间越长，组织损伤评分越高。

表2 各组小肠黏膜损伤评分Table 2 Histopathological scores of intestinal mucosa in different groups (n)

2.4 I-FABP和D-Lac与小肠黏膜组织损伤相关性分析

Spearman等级相关非参数检验结果表明，血清D-Lac浓度与组织损伤正相关（r＝1）；血清I-FABP浓度与组织损伤评分无相关性（r＝0.6）。

3 讨 论

I-FABP属于细胞质脂肪酸结合蛋白家族成员，富含于肠黏膜上皮绒毛中，正常情况下，周围血管中I-FABP含量很低，但当遭受炎症、缺氧、缺血及再灌注损害时，肠上皮细胞通透性增加，I-FABP释出，通过毛细血管及毛细淋巴管进入血循环，可在周围血中检测出[5]。I-FABP具有如下特点[6]：（1）是存在于胞质中的可溶性蛋白；（2）具有较高组织特异性；（3）组织含量丰富；（4）分子量低，易于检测。有研究表明：由于I-FABP更多的位于绒毛的顶端，在缺血早期能比肝脂肪酸结合蛋白（liver fatty acid banding protein，L-FABP）更早释放入血达到有效浓度[7]。赵海东等[8]用大鼠制作肠缺血模型，测定血清中的I-FABP含量，并与乳酸脱氢酶和肌酸激酶同工酶含量进行比较，发现肠缺血45min后血清I-FABP含量最高。刘牧林等[9]应用大鼠缺血再灌注模型，分别于肠缺血15min、肠缺血45min、肠缺血45min再灌注2h、肠缺血45min再灌注6h测定I-FABP浓度，发现缺血45min时I-FABP达峰值，而且I-FABP浓度与肠组织损伤程度正相关。

本研究发现，I-FABP在肠缺血30min即明显升高，90min达到峰值，而后随着缺血时间的延长，其水平下降。I-FABP浓度与组织损伤程度无相关性，但是在缺血早期，即缺血90min内，I-FABP与组织损伤程度正相关。病变肠组织免疫组化也显示：缺血90min组镜下染色阳性总个数、阳性总面积以及阳性率均为最高（68.3%～76.4%），进一步验证了此时被破坏的肠黏膜组织释放的I-FABP总量最高。本研究采用结扎大鼠肠系膜前动脉的方式造模，发现在持续肠缺血的情况下，血清I-FABP的浓度与肠组织损伤无相关性。考虑血清I-FABP浓度下降系由于缺血中后期富含I-FABP的肠黏膜绒毛组织破坏殆尽所致，提示当I-FABP水平下降时，缺血损害已侵及肠黏膜肌层。

D-Lac是肠道内细菌的主要酵解产物之一，肠道菌群中多种细菌都可以产生，发生肠缺血时，正常肠黏膜屏障被破坏，导致其通透性增加，致使血清D-Lac浓度升高[10]。D-Lac具有以下特点[11]：（1）肠道通透性发生改变时即可引起血中D-Lac的浓度变化；（2）人体内自身不产生D-Lac，且无D-Lac的代谢酶类，浓度相对稳定；（3）D-Lac为肠道内细菌代谢产物，其浓度改变具有较强的特异性。在本研究中，D-Lac水平在肠缺血早期升高不明显，自缺血60min开始明显升高，随着肠缺血时间的延长而持续明显升高，D-Lac与组织损伤具有明显相关性，提示D-Lac可作为判定肠黏膜损伤的指标。但在肠缺血早期，D-Lac浓度变化不明显。

综上所述，I-FABP在缺血90min内与肠组织损伤正相关，诊断敏感性较高，血清D-Lac在缺血60min后与肠组织损伤正相关。两种指标均能准确反应肠黏膜损伤，如果I-FABP升高，而D-Lac正常，说明肠黏膜受到损伤，但肠黏膜屏障尚完整；如果I-FABP和D-Lac同时升高，说明肠黏膜屏障可能已经受到破坏。因此，可考虑联合采用这两种指标，建立诊断模型用于急性肠缺血的早期诊断。

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