有机溶剂沉淀法去除子宫内膜癌血清高丰度蛋白的比较研究

陈锋菊张晓羲 宁丽红



有机溶剂沉淀法去除子宫内膜癌血清高丰度蛋白的比较研究

陈锋菊1,2, 张晓羲2, 宁丽红2

(1. 湖南第一师范学院 教育科学系,湖南 长沙, 410205; 2. 湖南科技大学 生命科学学院, 湖南 湘潭, 411201)

建立了一种简便有效、成本低廉的去除子宫内膜癌血清高丰度蛋白的方法. 运用3种不同的有机溶剂(不同体积倍数)处理子宫内膜癌血清样品, SDS-PAGE电泳检测去除高丰度蛋白. 结果表明: 不同的有机溶剂沉淀法都能去除血清样品中绝大部分的高、中丰度蛋白, 但低丰度蛋白质保留、减弱及丢失的现象不一.用1倍体积乙腈可有效去除子宫内膜癌血清样品中的绝大部分高丰度蛋白, 同时保留较多的小分子量蛋白.

有机溶剂; 子宫内膜癌; 高丰度蛋白

人体血清中含有种类多达上千种的蛋白质, 各种蛋白质的含量差异巨大. 而在某些疾病的病理过程中分泌入血的一些低分子量蛋白(<10 kD), 被称为生物标志物[1], 通常认为是一些激素、细胞因子、生长因子等[2—3]. 这些低分子量蛋白的含量相当少, 极易被高丰度蛋白所干扰, 不易显现出来. 因此在对血清蛋白进行研究时, 必须先设法去除血清中的高、中丰度蛋白, 即对低分子量蛋白进行分离提纯. 目前常用的方法主要有免疫亲和层析法、蛋白质沉淀法等. 本研究主要对几种不同的有机溶剂沉淀法去除血清中高丰度蛋白的效果进行比较研究.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1血清样品

2011年10月, 在湖南省肿瘤医院住院的子宫内膜癌患者6例(平均年龄56岁)、同时期的女性体检健康者6例(平均年龄53岁)中, 分别取清晨空腹静脉血3 mL, 迅速于4 ℃静置3 h, 3 000 r/min离心5 min, 提取上清液, 再将上清液静置5 min, 15 000 r/min离心30 min, 去掉白色絮状沉淀, 留上层血清. 分正常组和患者组, 将获得的血清分别混合, 以便消除个体差异. 冰上分装, 每EP管100 μL, 并于-80 ℃冻存备用, 避免反复冻融.

1.1.2 主要试剂和仪器

丙烯酰胺(Acr)、N, N′甲叉双丙烯酰胺(Bis)、十二烷基磺酸钠(SDS)、过硫酸铵(AP)、四甲基乙二胺(TEMED)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸(Gly)、琼脂糖购自上海生工生物工程有限公司, 考马斯亮蓝R-250、牛血清白蛋白(BSA)为Sigma公司产品, 垂直电泳槽为Bio-Rad公司产品, 高速冷冻离心机为 Eppendorf 公司产品.

1.2 方法

1.2.1 血清中高丰度蛋白去除

分别用丙酮、乙醇、乙腈3种不同的有机溶剂沉淀样品, 具体操作如下: 冻融血清, 4℃、12 000 r/min 离心5 min, 然后分3组. 第1组: 分别取上清液0.4 mL与0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL丙酮混合(构成1倍、1.5 倍、2 倍体积的丙酮), 得到3个样品; 第2组: 乙醇代替丙酮, 同样得到3个样品; 第3组: 乙腈代替丙酮, 又得到3个样品. 分别混合后, 立即震荡混匀约15 s, 置于摇床20 min( 60转, 20 ℃ )然后于4 ℃、12 000 r/ min离心10 min, 每个样品分别取600 μL上清液浓缩至 100 μL. 总共获得9个处理过的不同血清样品.

1.2.2 血清蛋白含量测定

蛋白质含量测定采用bradford法[4].

1.2.3 SDS-PAGE 电泳

分组对处理过的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳. 电泳结束后, 用考马斯亮蓝R-250染色, 最后脱色至背景清晰.

2 结果

与原血清相比, 丙酮、乙醇、乙腈等有机溶剂都能不同程度地去除血清样品中的高、中丰度蛋白, 结果见图1—4.

SDS-PAGE 电泳结果表明: 丙酮沉淀法中, 1倍体积的丙酮去除高、中丰度蛋白的效果相对较差, 且低分子量蛋白条带不清; 1.5 倍及2 倍体积的丙酮能较好地去除血清中的高、中丰度蛋白, 但其电泳图中9.5 kD 以下的小分子量蛋白条带不清晰或完全丢失, 如图2所示. 相同体积倍数下的3种不同有机溶剂中, 乙醇去除高、中丰度蛋白的效果最差, 且9.5 kD 以下小分子量蛋白条带数目较少或条带不清, 如图3 所示. 乙腈沉淀法中, 1.5 倍及2倍体积的乙腈能较好地去除血清中的高、中丰度蛋白, 但9.5 kD 以下的小分子量蛋白减弱或丢失的现象明显; 相比之下, 1 倍体积的乙腈去除高、中丰度蛋白的效果相对差些, 但电泳后9.5 kD 以下的低分子量蛋白条带数目较多, 分界较明显(图4).

图2 不同倍数丙酮沉淀样品SDS-PAGE 电泳图. 1—健康者血清; 2—子宫内膜癌血清; M—低分子量标准蛋白, A、B、C组泳道依次为1倍、1.5倍和2倍体积丙酮沉淀后样品.

3 讨论

众所周知, 人的生命活动以及各项生理功能的体现离不开蛋白质, 血清中又含有种类繁多的蛋白质. 因此, 对疾病和健康状态下的血清蛋白进行比较研究, 将有助于相关疾病的早期诊治及探明其发病机制. 但与疾病相关的蛋白质在血清中的含量相当低, 其信息几乎完全被高丰度蛋白所掩盖. 因此, 低丰度蛋白的分离提纯已成为血清样品处理中的重要步骤.

理想的蛋白质去除技术应该是尽可能多地去除会对低丰度蛋白检测造成干扰的高、中丰度蛋白, 同时又要尽可能多地保留所需要的低丰度蛋白, 避免造成流失[5]. 此外, 还要考虑成本、操作等诸多因素. 目前, 免疫亲和层析法在去除高丰度蛋白的效果方面具有极大优势[6], 但此法所需成本高, 操作步骤十分繁琐[7], 因此在实验室无法得到普及.

有机溶剂沉淀法是近年来在实验室应用较多的一种血清预处理方法. 大量研究表明, 丙酮、乙腈等有机溶剂都可以不同程度地沉降人体血清中的高、中丰度蛋白, 但基本都是单独使用丙酮[8—9]乙醇[10]或乙腈[11—16], 对于以上几种有机溶剂的沉降效果进行综合比较鲜见报道. 本研究运用不同体积倍数的3种不同的有机溶剂(丙酮、乙醇和乙腈)处理子宫内膜癌患者的血清样品, 探索研究去除该样本高丰度蛋白的最佳方法. 研究结果表明, 3种不同的有机溶剂都能去除人体血清样品中绝大部分的高、中丰度蛋白, 但低丰度蛋白质保留、减弱及丢失的现象不一.用1倍体积乙腈沉淀法可有效去除子宫内膜癌血清样品中的绝大部分高丰度蛋白, 同时保留较多的小分子量蛋白. 该结果稍不同于覃建等[13]和朱慧等[15]的研究结果, 主要原因可能因为覃建、朱慧等在使用乙腈沉淀蛋白质的同时, 还一并加入了其他的辅助试剂. 相比之下, 本研究所得方法更加简便易行, 且成本低廉, 为后期进行子宫内膜癌患者的血清蛋白质组学分析, 以及进一步筛选患者的差异蛋白奠定了一定的基础.

[1] Petricoin E F, Paweletz C P, Liotta L A. Clinical applications of proteomics: Proteomic pattern diagnostics[J] . J Mammary Gland Biol Neoplasia, 2002, 7: 433—440.

[2] Adkins J N, Varnum S M, Auberry K J, et al. Toward a human blood serumproteome: analysis by multidimensional separation coupled with mass spectrometry[J]. Mol Cell Proteomics, 2002, 1(12): 947—955.

[3] Steel L F, Trotter M G, Nakajima P B, et al. Efficient and specific removal of albumin from human serum samples[J]. Mol Cell Proteomics, 2003, 2(4): 262—270.

[4] 陈钧辉, 陶力, 李俊, 等. 生物化学实验[M]. 北京: 科学出版社, 2007: 110—116.

[5] 苟黎明, 邵小宝, 李克. 蛋白质组学研究中高丰度蛋白质去除方法的研究进展[J]. 临床检验杂志, 2010, 28(4): 298—300.

[6] Bellei E, Bergamini S, Monari E, et al. High-abundance proteins depletion for serum proteomic analysis: concomitant removal of non-targeted proteins[J]. Amino Acids, 2011, 40(1): 145—156.

[7] Ichibangase T, Moriya K , Koike K, et al. Limitation of immunoaffinity column for the removal of abundant proteins from plasma in quantitative plasma proteomics[J]. Biochem Chromatography, 2009, 23(5): 480—487.

[8] Chen Y Y, Lin S Y, Yeh Y Y, et al. A modified protein precipitation procedure for efficient removal of albumin from serum[J]. Electrophoresis, 2005, 26(11): 2117—2127.

[9] 王班琴, 秦兆宇, 柏淑美, 等. 双向电泳中人血清蛋白样品不同处理方法的比较[J]. 山东大学学报: 医学版, 2009, 47(11): 89—94.

[10] 潘俊, 罗晓阳, 陈海泉. 乙醇沉淀法去除人血清清蛋白的实验研究[J]. 医学研究生学报, 2008, 21(10): 1034—1035.

[11] Orvisky E, Drake S K, Martin B M, et al. Enrichment of low molecular weight fraction of serum for MS analysis of peptides associated with hepatocellular carcinoma[J]. Proteomics, 2006, 6(9): 2895—2902.

[12] Kay R, Barton C, Ratcliffe L, et al. Enrichment of low molecular weight serum proteins using acetonitrile precipitation for massspectrometry based proteomic Analysis[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2008, 22(20): 3255-3260.

[13] 覃健, 胡天桥, 张志勇, 等. 乙腈沉淀法去除人血清中高丰度蛋白的探索性研究[J]. 中国卫生检验杂志, 2010, 20(5): 963—964.

[14] 黄元姣, 邓开凤. 鼻咽癌血清蛋白质组学研究中乙腈沉淀法的应用[J]. 华南国防医学杂志, 2011, 25(6): 469—482.

[15] 朱慧, 李克, 翟云霞. 血清蛋白质组学研究中乙腈沉淀法去除血清蛋白的实验研究[J]. 临床检验杂志, 2011, 29(1): 16—18.

[16] Fernandez C, Santos H M, Ruiz-Romero C, et al. A comparison of depletion versus equalization for reducing high-abund- ance proteins in human serum[J]. Electrophoresis, 2011, 32(21): 2966—2974.

Comparative research on the elimination of high-abundance proteins in endometrial carcinoma serum by organic solvent method

CHEN Feng-ju1,2, ZHANG Xiao-xi2, NING Li-Hong2

(1. Department of Education and Science of Hunan First Normal University, Changsha 410205, China; 2. Biology Science College of Hunan University of Science and Technology, Xiangtan 411201, China)

To establish a simple and effective method on eliminating high-abundance proteins in endometrial carcinoma serum. Elimination of serum high-abundance proteins were practiced by different organic solvents with different volume. The removal effects were analyzed by SDS-PAGE. Different organic solvent methods could eliminate most of high- abundance proteins in human serum, but the retention, weakening and loss of low-abundance protein is not the same. 1 times volume of acetonitrile could more effective eliminate high- abundance proteins, and gain more proteins low molecular weight.

organic solvents; endometrial carcinoma; high- abundance proteins

10.3969/j.issn.1672-6146.2013.03.007

O 652.61

1672-6146(2013)03-0032-03

email: chenfengju526@163.com.

2013-05-21

湖南省教育厅资助项目(09c379)

(责任编校:谭长贵)