人体口腔微生物宏基因组的研究进展

邓盟　齐霞　徐欣等

[摘要] 人体生态环境中共生着数量庞大的微生物群落，被誉为人体第二基因组。口腔微生物与口腔及全身的健康和疾病有着密切的联系，新一代高通量基因芯片和第二代测序技术的涌现让人们对口腔微生物有了更全面的了解。本文就微生物宏基因组研究技术、口腔微生物宏基因组及其与口腔和全身疾病防治的最新进展进行综述。

[关键词] 口腔微生物组； 基因芯片； 第二代测序； 宏基因组

[中图分类号] R 780.2 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.027 人体生态环境中共生着数量庞大的微生物群落，包括数千种微生物，10～100万亿个微生物细胞，是人体躯体和生殖细胞总和的10倍；并含有2千万个独特的微生物基因，基因数量超过人体基因数量100倍。此外，微生物提供了人类进化所不具有的特殊代谢特性，微生物组的变异潜能远大于人体组织。因此，人体共生菌群被誉为人体第二基因组，而如果把人体和人体共生的微生物视为一个在基因构成和代谢功能上的混合体，这个混合体则称为“超生物体（superorganism）”。为了阐明人类健康和疾病与人体微生物组的关系，美国国立卫生研究院（Natio-

nal Institutes of Health，NIH）于2007年10月启动了耗资1.5亿美元的人类微生物组计划（Human Microbiome Project，HMP），计划在5年时间内建立涵盖3 000种微生物基因组序列的数据库，并进行人体呼吸道、口腔、皮肤、肠道、阴道的微生物组学分析，旨在阐明微生物组构成和功能与人体健康和疾病的关系。

口腔是微生物进入呼吸道、消化道、血液的门户，由于口腔特殊的解剖结构及生理特点，口腔中定植着复杂的微生物群落。口腔内环境稳态易受外界因素的干扰，口腔内部有多位点、多层次的微生物定植生态区，口腔环境的异质性较肠道更为明显。近几十年厌氧培养、分子生物学技术、高通量基因芯片和第二代测序技术的应用，让人们对口腔微生物群落的认识达到了前所未有的广度和深度。正常情况下口腔微生物群落之间、微生物与宿主之间密切且复杂的相互作用维持着宿主健康，这种生态平衡被打破将会引发疾病。由于口腔微生物组与口腔主要疾病及部分全身疾病密切相关，只有在全面认识口腔微生物组结构与功能、稳定与变异的基础上，才能深度揭示口腔微生物组与口腔及全身健康、疾病的关系，从而为疾病防治提供新的视角和策略。

1 微生物宏基因组研究技术

1998年Handelsman等[1]提出宏基因组的概念，是指生物环境中全部微小生物遗传物质的总和。然而传统口腔微生物研究方法依赖于微生物的分离培养，通过特定表型和生化性状鉴定微生物，这种方法对于评价微生物的抗生素敏感性和致病性极其有效，但由于环境中只有少量的细菌可培养（<1%），无法

对绝大多数微生物的系统发育关系及群落功能进行深度发掘。随着将分子生物学技术引入微生物生态学研究后[2]，近20年来逐渐建立了以16S rDNA系统发

育分析为基础的现代微生物分子生态学的研究体系，包括16S rRNA克隆测序、聚合酶链式反应-变性/温度梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing

gradient gel electrophoresis/temperature gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE/TGGE）、聚合酶链式反

应-末端限制性酶切片段长度多态性分析（polymerase chain reaction-terminal restriction fragment length po-lymorphism，PCR-T-RFLP）、聚合酶链式反应-变性

高效液相色谱（polymerase chain reaction-denaturing high performance liquid chromatography，PCR-DH-PLC）、棋盘DNA-DNA杂交技术（checkerboard DNA-DNA hybridization）等[3]，但这些技术通常只能检测

到环境中的优势菌群，其检测精度、分辨率不尽如人意，且耗时耗力，不足以全面彻底展现微生物世界。新一代高通量技术的涌现为口腔微生物宏基因组的深度研究带来了新的手段。

1991年Fodor等[4]提出了生物芯片（biochip）的概念，即能够快速并行处理多个生物样品并解析其中所包含的生物信息的微型器件。DNA微阵列是建立最早、发展最为成熟的生物芯片，其突出特点在于高度并行性、多样性、微型化和自动化[5]。2008年美国

福赛斯研究所研发出了人类口腔微生物鉴定芯片，嵌有272个口腔菌种的16s RNA寡核苷酸探针[6]，可以高效快速获取口腔微生物多样性的信息。2010年报道的新一代功能基因芯片Geochip 3.0含约28 000个探针，覆盖292个功能类群的57 000个基因，包括了来自细菌、真菌、古细菌参与碳循环、氮循环、磷循环、硫循环、能量传递、金属抗性、抗生素抗性、有机污染物降解的基因，以及gyrB系统发育标记[7]，不仅可以大规模快速分析微生物群落结构，更可以建立微生物群落功能和环境的联系。

1977年Sanger等[8]发明了双脱氧核苷酸末端终止测序法，经过不断改进，迅速成为第一代测序技术的主流，帮助学者完成了从病毒到人体基因组的测序工作。然而传统的Sanger法由于通量低、速度慢、成本高，不能完全满足后基因组时代科研的需求。2006年后第二代测序技术陆续诞生，第二代测序技术以合成测序为核心思想[9]，通过采集解析新合成端

的荧光信号确定核酸序列。第二代测序主要有Roche、Illumina、ABI和Helicos Biosciences 4家公司的平台，且各具特点。Roche、Illumina均使用DNA聚合酶测序，Roche平台的优势在于有效序列读长可以达到400～500 bp，可以有效覆盖16/18S rDNA、内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）可变区，得到对微生物多样性、群落结构、种系关系精确的解析；Illumina平台总测序量大，测序成本只有Roche的1/10，但有效序列读长短，常用于鸟枪法测序后将序列与功能基因进行匹配，研究微生物群落功能信息。ABI SOLiD的独特之处在于双碱基编码（two base encoding）的DNA连接酶测序[10]，即每种荧光信号与4种碱基对绑定，且每个位置测定两次，这样的纠错设计让ABI SOLiD成为第二代测序平台中最为准确的。HeliScope测序不需要对DNA进行扩增，避免聚合酶链反应（po-lymerase chain reaction，PCR）引起的偏倚，首次实现了单分子测序和RNA直接测序，但是HeliScope和SOLiD技术用于微生物组学却鲜有报道。第三、四代测序平台不依赖荧光检测系统或化学洗脱过程[11]，目前尚在研发中。

基因芯片和第二代测序是对传统技术的革新，突出优点在于：物种检测范围广，可检测正常存在的低丰度甚至痕量物种；研究定量化，序列读取杂交信号强度可以反映物种丰度信息；高通量研究，单次检测就可获得大量生物信息，第二代测序还有核酸条码同时标记和测定多个样品。另外Ahn等[12]同时用Roche二代测序和人类口腔微生物鉴定芯片研究了口腔微生物组，发现两种技术检测菌群多样性和丰度具有良好的一致性和相关性。但是二者又各具特点，基因芯片是封闭结构，只能检测已知的序列，探针设计、芯片制作复杂，但是后续“模拟”数据处理相对容易，可用于已知微生物群落的常规研究，且费用较低。第二代测序是开放结构，优势在于可以寻找发现新的生物信息，待测样品制备容易，但是“数字”数据提取处理复杂，费用较高，主要用于未知环境微生物群落结构、生态功能的深度研究，因此应根据不同的研究需要合理选择。

2 口腔微生物宏基因组

口腔是人体微生物定植生存的重要生态区，口腔微生物不仅有细菌，还包括真菌、病毒、螺旋体及古细菌等。口腔多层次多位点的微生态区定植着显著不同的微生物群落。目前NIH正在进行健康成人微生物组研究，招募了300名受试者，采集每个个体呼吸道、口腔、皮肤、肠道、阴道微生物样品，其中口腔的采集位点包括附着龈、硬腭、咽喉、腭扁桃、舌背、颊黏膜、龈上菌斑、龈下菌斑、唾液，占全身18个采集位点的9个[13]。Dewhirst等[14]甚至认

为口腔相毗连的部位，如扁桃体、咽、食道、耳咽管、中耳、气管、肺、鼻腔、鼻窦等中的微生物也

属于口腔微生物组的范围。目前基于第二代测序技术的宏基因组学研究已经从整体上揭示了健康人体口腔微生物组的生物多样性，以及口腔微生物组的稳定与变化。

2008年美国福赛斯研究所和英国国王学院联合

在NIH牙颅颌面研究所（National Institute of Dental

and Craniofacial Research，NIDCR）建立了人类口腔

微生物组数据库（human oral microbiome database，

HOMD）[15]。目前HOMD中详细记录了13门619种口腔微生物分类群的系统发育树、16S rRNA及基因组的信息。这13门分别是：放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、衣原体门（Chlamydiae）、绿弯菌门（Chloroflexi）、广古菌门（Euryarchaeota）、厚壁菌（Firmicutes）、梭杆菌门（Fusobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、螺旋体门（Spirochaetes）、SR1、互养菌门（Synergistetes）、柔膜菌门（Tenericutes）和TM7。其中65.6%的微生物已被培养，约290种细菌菌种已被培养和正式命名[14]。Dewhirst等[14]进一步研究认为口腔微生物谱共包括1 179个种系型，其中有24%已被命名，8%已被培养但未命名，68%未培养。Zaura等[16]研究发现平均每个个体的口腔中共有266

个系统发育型。Keijser等[17]甚至发现口腔微生物涵

盖22个门318属，其中唾液185属，菌斑267属，唾液和菌斑分别有5 600、10 000个种系型，并发现了与参考序列差异10%的新5 305个新种系型。Nasidze等[18]发现唾液微生物涵盖了101个已知细菌属，其中39个属首次在口腔中发现，另外还发现了64个未知细菌属。这些研究结果不尽相同，与取样部位和方法、个体差异、样本制备、引物选择、16S rRNA可变区间的差异、操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）设值等有关，但这些结果提示以往的研究远远低估了庞大的口腔微生物谱。

Costello等[19]测序了9个健康人全身27个部位、4个时间点的微生物群落，发现人体的不同部位微生物群落构成有着显著差异，有特征性的微生物组，其中口腔和肠道有着最有特征的微生物组。不同个体同一部位的微生物群落显示一定的个体间差异，而个体内微生物组构成随时间的差异最小。与人体其他部位相比，口腔的微生物组显示了最小的个体内时间依赖性和个体间的变异。Bik等[20]的研究也证实口腔微生物组与人体其他部位微生物组构成显著不同，且至少有15个细菌属在不同个人之间保守存在，但在菌种和菌株水平有显著的个体间差异。Nasidze等[18]分析了5个洲人群的唾液样本，发现口腔微生物组构成有着个体内和个体间的差异，个体间的差异与不同的地区来源没有关系。Zaura等[16]测序了3个健康个体口腔牙面、颊、硬腭、舌、唾液5个部位的微生物组，发现牙齿邻面微生物多样性最高，颊部微生物多样性最低，主成分分析可以区分牙表面和软组织表面的微生物群落。3个个体的微生物组构成有较大的重叠，占66%测序内容的1 660个序列在3个个体间共同存在。Crielaard等[21]发现随着儿童年龄逐渐

增长，口腔中普氏菌、韦荣氏球菌、螺旋体和TM7所占比例逐渐升高，反映了微生物组随着儿童生长发育的逐渐成熟过程。这些研究提示口腔微生物组生物多样性构成与人体其他部位显著不同，口腔微生物组有着个体间以及个体内时间、空间依赖性的差异，但这种差异与全身其他部位相比较小，提示口腔可能存在有更大的核心微生物组。

此外，Ghannoum等[22]应用ITS引物首次鉴定了人类口腔的基本真菌组。健康人的口腔中共检测出74种已培养的真菌属和11种尚未培养的真菌属。假丝酵母菌检出率最高，接下来依次是枝孢菌、酵母菌、短梗霉、黄曲霉、镰孢菌、隐球菌属，其中4种是已知的人体致病菌。Willner等[23]首次分离并鉴定了

口腔DNA病毒组，共发现了260种DNA病毒，其中一种是EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV），其余都是

噬菌体，并且找到了大肠杆菌噬菌体T3（Escherichia coli phage T3）、痤疮丙酸杆菌噬菌体PA6（Propio-

nibacteriumacnes phage PA6）以及缓症链球菌噬菌体SM1（Streptococcus mitis phage SM1）完整基因组。其中SM1的pblA和pblB基因可以调节缓症链球菌对血小板的黏附，在缓症链球菌对心内膜的毒力中发挥了重要作用，pblA和pblB基因也是首次在唾液中被发现。目前唾液成分中尚未发现古细菌，但Lepp等[24]发现34%的牙周炎患者牙周袋内可以找到产甲烷古细菌（Methanogenic Archaea），且其丰度与牙周炎严重程度相关。健康人群的口腔微生物宏基因组研究也有助于了解宿主一生中的功能性事件对于口腔微生物组的影响。Lif Holgerson等[25]比较了剖腹产和阴道分娩的婴儿口腔微生物组的差别，研究发现Slackia exigua只存在于剖腹产婴儿口腔中，阴道分娩的婴儿口腔细菌种类多于剖腹产的婴儿。

3 口腔微生物宏基因组与口腔及全身疾病

口腔主要疾病如龋病、牙周病及口腔癌等严重影响人类的生命健康，多种环境和宿主因素可通过细菌间复杂精细的相互作用引起口腔微生物群落的生态转换，导致生理性菌斑向病理性菌斑转变，从而引发疾病，而口腔微生物群落的病理性改变也是宿主微生物稳态失调的早期反映。口腔宏基因组研究可比较健康和疾病状态下微生物组结构功能的差异，从微生物多样性、生态特征的角度揭示微生物和疾病的关系，并通过分析基因构成展现微生物群落生态功能的改变，为疾病防治提供新的靶点和思路。

3.1 龋病

Ling等[26]比较了患龋和无龋儿童的唾液和龈上菌

斑，并未发现特异的致龋菌，患龋儿童和无龋儿童龈上菌斑群落结构有鉴别特征，链球菌、韦荣菌、放线菌、毗邻贫养菌、纤毛菌、硫单胞菌组成的群落与龋病显著相关。Yang等[27]结合16S rRNA和全基因组测序技术，分析了19个龋活跃个体和26个无龋个体的唾液微生物，发现患龋个体的微生物组变异更大，无龋个体的微生物组构成相对保守；龋病组和无龋组微生物群落构成明显不同，龋病个体唾液中普氏菌属丰度很高，普氏菌菌种分布与健康组也有显著差别。未发现龋病特异的OTU，但是发现147个OTU与龋病相关，可作为评估龋病风险和预后的生物标记。Belda-Ferre等[28]测序了2个无龋个体、2个轻度龋个体、2个重度龋个体的龈上菌斑，发现龋病的优势菌并不是变异链球菌，而是由数十个菌种构成的复杂群落。功能基因组分析显示患龋个体的微生物组混合酸发酵、DNA摄取、感受态相关的基因上调；而无龋个体微生物组部分功能基因，包括抗菌肽、周质应激反应基因、胞外多糖、杆菌肽应激基因等过度表达。此外将无龋个体菌斑的优势菌种与患龋个体的微生物组共培养，发现了包括格氏链球菌、血链球菌、缓症链球菌在内的16个链球菌菌种可以产生抑菌环。这些研究提示龋病并不是由个别致龋菌如变异链球菌引起的，而是多菌种构成的致病群落引起的。致龋微生物组和正常微生物组在群落结构和基因功能上有显著的鉴别特征，可以作为龋病防治的生物标记；未患龋个体的微生物组是龋病防治的基因资源库，从中可以寻找有效的抗菌肽和益生菌作为新型的抗龋药物。

3.2 牙周病

目前应用第二代测序技术研究牙周病微生物宏基因组尚未有报道，现有研究主要集中于应用人类微生物组鉴定芯片。Olson等[29]研究了西弗吉尼亚人群的龈下菌斑，发现轻度牙周炎和龋病的个体含有大量韦荣菌和链球菌以及中等数量的二氧化碳噬纤维菌，而重度牙周炎和龋病个体口腔微生物种类更丰富，包括一大类的梭菌目细菌，且梭菌是重复定植菌。这项研究提示口腔环境也可影响龈下菌斑的生物多样性。Colombo等[30]发现在顽固性和可治性牙周炎患者龈下菌斑的细菌种类比健康人的多，且含有更多的牙周炎致病菌。Albandar等[31]研究了掌跖角化-牙周破坏综合征牙周炎患者的龈下菌斑，总共发现170种细菌，每个个体有40～80种，其中伴放线放线杆菌、空肠弯曲杆菌、颗粒二氧化碳噬纤维菌、麻疹孪生球菌、牙髓卟啉单胞菌、链球菌和福赛斯坦纳菌等在掌跖角化-牙周破坏综合征牙周炎患者中高频率检出，提示牙周炎致病菌与慢性、侵袭性牙周炎相关，机会性病原菌与重度牙周炎相关。

3.3 口腔癌

Pushalkar等[32]研究了3个口腔扁平细胞癌患者的唾液微生物组，共发现8门微生物，主要由厚壁菌门和拟杆菌门微生物组成。微生物多样性更为丰富，860个（33%）已知菌种，非培养或未归类的菌种占

67%，还有15个独特种系型在3个患者唾液内都存在，提示口腔癌伴随有口腔微生物组的结构改变，口腔微生物组有可能用于口腔癌的早期诊断。

3.4 全身疾病

微生物宏基因组技术也可以用于揭示全身疾病的可能病因，或用于发现全身疾病的早期诊断生物标记物。动脉粥样硬化斑块中的微生物来源尚不明了，Koren等[33]比较了15个患者的动脉粥样硬化斑

块、口腔及肠道里的微生物组在丰度、多样性方面的差异，发现动脉粥样硬化斑块含有较多的变形杆菌和较少的厚壁菌，另外浅黄假单胞菌（Pseudomo-nas luteola）只存在于动脉粥样硬化斑块中。口腔中的韦荣菌和链球菌合并丰度与动脉粥样硬化斑块中的丰度呈相关关系。口腔梭杆菌丰度与胆固醇和低密度脂蛋白呈正相关关系，链球菌丰度与高密度脂蛋白和载脂蛋白ApoAI正相关，奈瑟菌丰度与高密度脂蛋白和载脂蛋白ApoAI负相关。Docktor等[34]比较

了炎症性肠病儿童与健康儿童舌背微生物组，发现炎性肠病儿童微生物组总的多样性降低。Farrell等[35]用同样的技术比较了胰腺癌患者和健康个体的唾液微生物组，发现胰腺癌患者31种细菌丰度升高，25种细菌丰度降低，其中长奈瑟菌（Neisseria elongata）和

缓症链球菌可作为生物标记物区别胰腺癌患者和健康个体，并具有96.4%敏感性和82.1%特异性。

4 结束语

微生物与人类共生了数百万年，口腔微生物组结构、功能的生态平衡与口腔及全身的健康、疾病密切相关。高通量DNA芯片和第二代测序技术使全面深度研究口腔微生物组成为可能，口腔健康、疾病状态下微生物功能基因组，以及宿主遗传背景、生活方式和生平功能性事件对口腔微生物组的影响仍需要更进一步研究。可以预见，未来口腔微生物功能基因组芯片、更加平民化的测序平台及新的生物信息处理技术的涌现将开启个体化口腔医疗时代。

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（本文编辑 杜冰）