高迁移率族蛋白N2抑制口腔鳞状细胞癌增殖作用的体外研究

董小倩　刘西茜　张永红等

[摘要] 目的 以人口腔鳞状细胞癌细胞株Tca8113为实验模型，初步探讨高迁移率族蛋白N2（HMGN2）抗口腔鳞

状细胞癌的作用。方法 大量培养重组人HMGN2表达载体大肠杆菌BL21，用异丙基-1-硫代-β-呋喃半乳糖苷（IPTG）诱导HMGN2的表达，产物用B-PER GST Fusion Protein Purification Kit进行纯化。在细胞培养基中加入不同质量浓度的HMGN2，通过MTT、Hoechst 33342荧光染色、流式细胞术和Western-blot法检测其凋亡效果及抗凋亡的分子机制。结果 经MTT检测证明HMGN2能显著抑制Tca8113细胞的生长，通过Hoechst 33342荧光染色、流式细胞术和Western-blot检测证明HMGN2能使Tca8113的细胞形态发生改变，并且能使Tca8113细胞阻滞于细胞周期的S期，促进Tca8113细胞凋亡。结论 HMGN2可以促进人口腔鳞状细胞癌细胞的凋亡。

[关键词] 高迁移率族蛋白N2； 人口腔鳞状细胞癌细胞株； 凋亡

[中图分类号] R 730.5 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.022 高迁移率族蛋白N2（high mobility group chro-

mosomal protein N2，HMGN2）属于高迁移率族蛋白

（high mobility group chromosomal protein，HMG）三大家族成员之一，是一种进化保守的非组蛋白，在脊椎动物和非脊椎动物的细胞核中含量非常丰富[1]；其相对分子质量约为9.2×103，由90个氨基酸残基组成[2-3]。学者们[4-5]在人淋巴因子激活杀伤细胞（lym-phokine-activated killer cell，LAKC）和人宫颈液中分离纯化抗菌肽的过程中发现，HMGN2在体外有较强的抗革兰阴性菌和抗乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）活性。通过基因杂交的方法发现HMGN2多基

因家族中的功能基因仅有1个，位于染色体1p36。有研究[3]发现：1p区域具有多个肿瘤抑制基因，且1p36

区域的染色体异常与多种肿瘤的发生有关，由此推测HMGN2可能具有抗肿瘤活性。本文主要研究其体外抗人口腔鳞状细胞癌的功能。

1 材料和方法

1.1 材料

重组人HMGN2表达载体大肠杆菌BL21、人口腔

鳞状细胞癌细胞株Tca8113（四川大学口腔疾病研究国家重点实验室保存）。B-PER GST Fusion Protein Purification Kit（Thermo公司，美国）、BCA Protein

AS Say Kit（Pierce公司，美国），改良型RPMI1640培养基（Hyclone公司，美国），新生牛血清（上海复蒙基因生物科技有限公司），MTT（Amreesco公司，美国），Hoechst 33342（Sigma公司，美国），Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期检测试剂盒、全蛋白试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）。

1.2 HMGN2蛋白的分离纯化及其质量浓度的测定

将重组人HMGN2表达载体大肠杆菌BL21接种

于固体Luria-Bertani（LB）培养基中培养，挑选单个菌落接种于10 mL LB液体培养基中，37 ℃振荡过夜；以1∶1 000的体积比接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃振荡6 h后加入异丙基-1-硫代-β-呋喃半乳糖苷（isopropyl-1-thio-β-galactopyranoside，IPTG）诱导过夜，离心收集细菌，每克菌加入3 mL含苯甲基磺酰氟化物（phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF）的裂解液，冰上裂解20 min，超声破碎菌体，4 ℃、1.4×104 r·min-1离心20 min，收集上清液过滤，过滤后的样品经B-PER GST Fusion Protein Purification Kit进行纯化，收集HMGN2蛋白并保存。按照试剂盒说明书描述的方法，采用BCA法测定蛋白质质量浓度。

1.3 HMGN2蛋白对Tca8113细胞增殖的抑制作用

1.3.1 细胞培养 Tca8113细胞用含10%新生牛血清的RPMI1640培养基置于37 ℃、5%CO2孵箱内培养。待细胞汇合达80%以上时用胰蛋白酶消化，离心收集细胞，RPMI1640培养基重悬。

1.3.2 HMGN2蛋白对Tca8113细胞增殖的抑制作用 将消化好的Tca8113细胞以每孔1×104个的密度接种于96孔板中，待细胞贴壁后弃去原培养基，PBS洗2次。用无血清培养基稀释HMGN2至不同的质量浓度，分别为0、1、2、2.5、3、4、5 μg·mL-1，每个质量浓度设5个平行复孔，将HMGN2与Tca8113细胞共培养，37 ℃作用2～3 h后再加含体积分数为20%血清的培养基，培养48 h后用MTT法于酶标仪上测定光密度（optical density，OD）值。以HMGN2的质量浓度为横轴，OD值为纵轴作图，比较各组细胞的生长情况。

1.3.3 HMGN2蛋白对Tca8113细胞生长及形态的影响 将消化好的Tca8113细胞以每孔5×104个的密度接种于24孔板中，细胞贴壁后弃去原培养基，PBS洗2次。用无血清培养基稀释HMGN2至不同的质量浓度，分别为0、1、2、3 μg·mL-1，将HMGN2与Tca8113细胞共培养，37 ℃作用2～3 h后加入含体积分数为20%血清的培养基，培养24、48、72、96 h后于光学显微镜下观察细胞的生长情况及形态变化。

1.3.4 Hoechst 33342荧光染色法检测细胞凋亡 将消化好的Tca8113细胞以每孔5×104个的密度接种于24孔板中，细胞贴壁后弃去原培养基，PBS洗2次。用无血清培养基稀释HMGN2至不同的质量浓度，分别为0、1、2、3 μg·mL-1，将HMGN2与Tca8113细胞共培养，37 ℃作用2～3 h后加入含体积分数为20%血清的培养基，孵育24 h后吸尽每孔的培养基，PBS洗2次后加入4%多聚甲醛200 μL固定3～5 min，PBS洗2次，加入200 μL质量浓度为10 μg·mL-1的Hoechst 33342，避光反应30 min，PBS洗2次后置于倒置荧光显微镜下观察。

1.3.5 Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率 将消化好的Tca8113细胞以每孔5×105个的密度接种于6孔板中，细胞贴壁后弃去原培养基，PBS洗2次。用无血清培养基稀释HMGN2至不同的质量浓度，分别为0、1、2、3 μg·mL-1，将HMGN2与Tca8113细胞共培养，37 ℃作用2～3 h后加入含体积分数为20%血清的培养基，24 h后收集细胞检测细胞凋亡，操作按Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书进行。

1.3.6 HMGN2蛋白对Tca8113细胞周期的影响 将消化好的Tca8113细胞以每孔5×105个的密度接种于6孔板中，细胞贴壁后弃去原培养基，PBS洗2次。用无血清培养基稀释HMGN2至不同的质量浓度，分别为0、1、2、3 μg·mL-1，将HMGN2与Tca8113细胞共培养，37 ℃作用2～3 h后加入含20%血清的培养基，培养24 h后收集细胞，流式细胞术检测细胞周期，操作按细胞周期检测试剂盒说明书进行。

1.3.7 Western-blot法检测Tca8113细胞凋亡蛋白的表达 取2瓶生长良好的Tca8113细胞，弃去原培养基，PBS洗2次。用无血清培养基稀释HMGN2至不同的质量浓度，分别为0、2 μg·mL-1，将HMGN2与Tca8113细胞共培养，37 ℃作用2～3 h后加入含体积分数为20%血清的培养基。24 h后收集细胞，检测凋亡蛋白的表达，按试剂盒说明书提取细胞总蛋白，然后用Western-blot法检测内参照磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）、P53、Bax、Bcl-2和Caspase-3的表达。抗体采用鼠抗GAPDH（1∶1 000）、兔抗P53（1∶500）、兔抗Bax（1∶500）、兔抗Bcl-2（1∶500）、兔抗Caspase-3（1∶500）。

1.3.8 统计学处理 以SPSS 13.0统计软件处理数据，统计方法采用方差分析，检验水准为双侧α=0.05。

2 结果

2.1 HMGN2蛋白对Tca8113细胞增殖的抑制作用

不同质量浓度HMGN2作用后的细胞增殖情况见

组的差异即有统计学意义（P<0.01），随着HMGN2质量浓度的增加，其抑制作用逐渐增强。

2.2 HMGN2蛋白对Tca8113细胞生长及形态的影响

不同质量浓度的HMGN2作用后培养不同的时间，Tca8113细胞的生长情况和形态变化见图2：与对照组（0 μg·mL-1）相比，1 μg·mL-1 HMGN2组的细胞数量即出现明显减少；随着HMGN2质量浓度的增加，细胞数量减少更为明显，HMGN2的抑制作用逐渐增强；同时可见细胞形态异常，出现核浓缩、碎裂，有凋亡小体形成。随着HMGN2质量浓度和培养时间的增加，细胞逐渐死亡。

2.3 Hoechst 33342荧光染色法检测细胞凋亡

Hoechst 33342荧光染色法检测结果见图3：对照组（0 μg·mL-1）细胞核基本不着色，HMGN2组细胞呈

强荧光染色，说明HMGN2组细胞膜对Hoechst 33342摄取增高、结合增强，细胞出现凋亡；随着HMGN2质量浓度的增加，凋亡的细胞逐渐增多；3 μg·mL-1 HMGN2组染色细胞的数量明显减少，是因为大量细胞死亡，而死亡细胞不被Hoechst 33342染色所致。

2.4 Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测细胞

凋亡率

Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测结果见图4：对照组细胞的早期凋亡率为2.7%，总凋亡率为4.9%；1、2、3 μg·mL-1 HMGN2组的早期凋亡率分别为11.2%、36.9%、59.5%，总凋亡率分别为17.6%、64.7%、77.0%；与对照组比较，细胞的凋亡率随着HMGN2质量浓度的增加而升高（P<0.05）。

2.5 HMGN2蛋白对Tca8113细胞周期的影响

HMGN2蛋白作用后Tca8113细胞的生长周期检测结果见图5：随着HMGN2质量浓度的增加，S期细胞所占比例逐渐增加，G0/G1和G2/M期细胞的比例逐渐减少，提示HMGN2阻滞Tca8113细胞于S期。

2.6 Western-blot法检测Tca8113细胞凋亡蛋白的表达

Tca8113细胞经HMGN2蛋白作用后，细胞总蛋白中凋亡促进蛋白Bax和P53表达量增加，而凋亡抑制蛋白Bcl-2和Caspase-3表达量减少（图6）。该结果提示HMGN2可以导致Tca8113细胞的凋亡。

3 讨论

目前HMG蛋白分为三大家族：HMGA、HMGB、HMGN。HMGN2属于HMGN蛋白亚家族。HMGN蛋白亚家族具有典型的功能结构域即核糖体结合域（nu-cleosomal binding domain，NBD），可将蛋白质锚定于核小体的中心[1]。这类蛋白质包括一个强势的N-

末端区域，具有对核转运和核小体结合分别起作用的核定位信号区（nuclear localization signal，NLS）和

NBD[6-7]，具有高度保守的结构，因其C-末端是酸性的，目前认为在利于转录的高阶染色质结构重排中起着重要的作用[6，8-9]。研究[10-11]显示，HMGN2可能具有更复杂的功能。Spieker等[3]对25株肿瘤细胞进行

了分析，发现人染色体1p区域具有多个肿瘤抑制基因，如CHD5（chromodomain helicase DNA-binding

protein5）、RUNX3（runt related transcription factor

3）等；1p36这一区域的染色体异常与多种肿瘤的发生有关，HMGN2基因恰恰定位于此，提示该分子可能具有抗肿瘤活性。Porkka等[11]通过实验证明，HMGN2的N-末端31个氨基酸残基能结合骨髓上皮原生细胞和肿瘤血管内皮细胞。由此可见，探讨HMGN2在肿瘤发生发展中的功能和机制意义重大。

本实验用MTT法检测出HMGN2对Tca8113细胞的半数致死量为2 μg·mL-1，因此选择HMGN2的质量浓度为0、1、2、3 μg·mL-1。经Hoechst 33342荧光染色和流式细胞术检测发现，HMGN2可促进Tca8113细胞凋亡，且有剂量依赖关系，随着HMGN2质量浓度的增加，Tca8113细胞的凋亡率也逐渐增高，尤其HMGN2为3 μg·mL-1时，出现了大量的死亡细胞。经细胞周期检测发现，HMGN2作用于Tca8113细胞后，阻滞其于S期。有文献[12]报道，沉默ORAOV1（oral

cancer overexpressed 1）基因是通过抑制DNA复制

和调节相关周期蛋白（如cyclin A、cyclin B1和cdc2等）的表达而阻滞Tca8113细胞于S期的。HMGN2对

Tca8113细胞周期阻滞的相关机制仍需进一步的研究。HMGN2主要通过诱导细胞凋亡而杀伤细胞。凋亡主要通过两条信号通路进行[13-14]，一条是线粒体途

径即内在途径，另一条是死亡受体途径即外在途径。在内在途径中，P53通过促进细胞色素C的释放而导致细胞凋亡；Bcl-2通过抑制细胞色素C的释放而抑制细胞凋亡；Bax是与Bcl-2位于同一信号通路，但与其作用相反的凋亡促进蛋白。Western-blot检测结果显示，HMGN2可以通过内在途径导致Tca8113细胞凋亡[15]，但具体机制还需进一步的研究。

本研究发现，HMGN2对Tca8113细胞增殖具有明显的抑制作用。目前治疗肿瘤方法如放化疗的不良反应较大，HMGN2是存在于人淋巴细胞中的天然蛋白，能在很大程度上减少耐药性及不良反应，有望作为抗肿瘤药物用于临床，但仍需进行深入研究。

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（本文编辑 吴爱华）