脂肪干细胞复合载杜仲醇提取物支架材料修复兔下颌骨缺损的实验研究

房殿吉　郭延伟　李松等

[摘要] 目的 探讨杜仲醇提取物对脂肪干细胞成骨分化的促进作用及脂肪干细胞复合载杜仲醇提取物支架材料应用于颌骨缺损修复的可行性。方法 将48只新西兰大白兔随机分为4组，并制备双侧下颌骨缺损模型。A组植入脂肪干细胞复合载杜仲醇提取物支架材料；B组植入脂肪干细胞复合羟磷灰石材料；C组单植入羟磷灰石材料；D组为空白组。分别于术后2、4、8、12周处死实验动物，制备组织标本，行大体观察、影像学分析、苏木精-伊红（HE）染色、扫描电镜（SEM）检测，并对影像学分析值及成骨情况进行评价，采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析。结果 影像学检查及组织学染色显示A组骨缺损处愈合程度、成骨速度及其质量明显优于其他3组。SEM观察可见，A组复合材料与组织相容性好，无炎症刺激反应。统计牙CT分析数据及新生骨面积，A组的成骨情况优于其他3组（P<0.05）。结论 杜仲醇提取物有促进脂肪干细胞向成骨细胞转化的作用，脂肪干细胞复合载杜仲醇提取物支架材料也具有明显骨诱导作用，是一种新型复合材料，可望成为临床应用中修复下颌骨缺损的新型材料。

[关键词] 骨； 下颌骨缺损； 杜仲醇提取物； 脂肪干细胞； 羟磷灰石

[中图分类号] Q 254 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.017 近年来随着组织工程学和细胞生物学的发展，利用种子细胞复合支架材料修复骨缺损成为新的研究方向，以往骨髓间充质干细胞作为种子细胞一直是研究的热点[1-2]，但由于人体骨髓间充质干细胞在骨髓单核细胞中所占比例较少，且随着年龄的增大比例逐年下降，尤其老年人获取数量更少，从而限制了其在临床的应用。脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）作为新的种子细胞，由于其有来源丰富、取材方便、对机体组织损伤小、增殖快、能多向分化、获取数量大等众多优点迅速成为新的研

究热点[3-4]。大量研究发现中药杜仲能刺激骨髓干细胞向成骨细胞的分化[5-7]，因为ADSCs与骨髓干细胞

有相同的表面黏附因子和受体分子，所以有同样的多向分化潜能。本研究将探讨杜仲醇提取物对ADSCs的成骨分化促进作用和以ADSCs为种子细胞复合载杜仲醇提取物支架材料修复颌骨缺损中的作用，为临床治疗下颌骨缺损提供实验基础和理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

选择由佳木斯大学动物实验中心提供的健康新西兰大白兔48只为研究对象，体重2.0～3.0 kg，6月龄，雌雄不限。

1.2 材料

DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶（Gibco公司，美国），胰岛素、地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠（Sigma公司，美国），医用纳米级羟磷灰石（上海源叶生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 杜仲醇提取物的制备 2 g盐杜仲（山东省济南市漱玉大药房，1包1 g，生产批号：110316）加入甲醇至15 mL，室温振荡1 h，静置过夜，15 000 r·min-1离心10 min，弃沉淀。甲醇浸上清经真空浓缩，再加水15 mL溶解后得醇提取物。醇提取物均经0.22 Em膜过滤，-20 ℃保存。

1.3.2 兔ADSCs的分离和培养 麻醉下取兔两侧腹股沟脂肪组织，置于培养皿中，无菌条件下清除小血管、外包膜和软组织，PBS缓冲液冲洗3次，眼科剪剪碎，用1 g·L-1Ⅰ型胶原酶37 ℃水浴下消化1.5 h至糊状，2 600 r·min-1离心10 min，除去上清和上层悬浮油性脂肪组织，D-HANK S液洗涤沉淀2次。用含10%胎牛血清DMEM培养基稀释，过滤，离心，将细胞收集到培养瓶中。于37 ℃饱和湿度，体积分数5%CO2中进行培养，细胞融合80%～90%时，用含0.25%胰酶消化，传代培养后进行成骨诱导，茜素红染色进行成骨鉴定。

1.3.3 复合材料的制备 将培养第6代的ADSCs经胰蛋白酶消化和离心后与杜仲醇提取物15 mL复合，细胞计数，制成的细胞悬液浓度为每毫升2×107个。而后将羟磷灰石置于培养皿中，细胞悬液反复滴加到支架材料上，保证支架材料完全浸润。同时在37 ℃、5%CO2培养箱培养24 h，使ADSCs更好地进入支架材料的孔隙中。

1.3.4 实验分组 将制备成下颌骨缺损模型的48只新西兰大白兔分为4组。A组植入ADSCs复合载杜仲醇提取物支架材料；B组植入ADSCs复合羟磷灰石材料；C组单植入羟磷灰石复合材料；D组为空白组，不植入任何材料。

实验动物称重后，20%乌拉坦（5 mL·kg-1）耳缘静脉注射麻醉。常规备皮消毒铺巾，沿下颌骨下缘做平行切口，长度3～4 cm，分层切开皮肤皮下组织，暴露下颌骨下缘及颊面，用裂钻在下颌骨体颊侧中下处制备直径为1 cm的全层骨缺损，深度为0.5～0.6 cm，注意术中生理盐水降温，不损伤对侧骨膜层结构。手术中，A、B、C组按分组植入相应材料，D组制备缺损后直接缝合。充填完毕后，分层严密缝合切口，分笼饲养。术后肌注庆大霉素预防感染，剂量为每次2万单位，1 d2次，持续5 d。分别于术后2、4、8、12周静脉栓塞法处死动物，获取兔双侧完整下颌骨标本。

1.3.5 观察指标 观察指标具体如下。1）大体观察：观察骨缺损区表面情况及新骨形成和材料吸收情况，探针检测缺损表面骨形成硬度。2）影像学分析：X线片观察骨缺损区外形及材料的改变情况，材料与周围组织接触情况。牙CT扫描骨缺损区内8个不同位点，并记录CT值，取均值。3）组织学观察：于骨缺损区周围0.5 mm处取材，4%多聚甲醛固定24 h后常规脱钙处理，而后将标本浸蜡、包埋、切片、苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，光镜下进行观察。4）扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）观察：将组织块置于4%戊二醛固定液24 h取出，PBS液冲洗3次，梯度乙醇脱水，醋酸异钨酯中置换15 min，SEM检测材料与周围组织密合情况及生物相容性。5）计算机图像分析：术后4个时间段所有组织连续切片后系统选片，每块组织选5张，光镜（100倍）下每张切片随机选取6个视野，在图像分析仪下进行组织学形态分析，测定术后各个时间点上新生骨小梁面积所占修复区面积的比值。

1.4 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行分析，对CT值及新骨形成面积进行统计分析，数据以x±s表示，组间和组内CT值及新骨形成面积差异的比较采用t检验分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ADSCs的培养及成骨鉴定结果

倒置显微镜下可见原代细胞4～6 h后开始沉降；24 h后基本贴壁；2～4 d后呈梭形或小多角形，突起相互连接；7 d后大量增殖，呈束状或漩涡状排列。传代后呈梭形，形态大小较一致，各代细胞形态无明显变化，呈成纤维细胞样生长。14 d后茜素红矿化

结节染色说明分化形成的细胞为成骨细胞（图1、2）。

2.2 大体观察结果

术后2周，A组骨缺损区材料与周边组织固位良好，界清，材料有小部分吸收；B组和C组缺损区有包膜包裹，有炎性渗出，材料完整；D组见少量纤维形成，炎性增生。术后4周，A组缺损区大量红色纤维组织，有骨痂形成，硬度增加，材料部分溶解吸收；B组缺损区材料与周围骨质界限明显，材料留存明显，骨痂较少；C组材料界清，材料未被吸收；D组见大量纤维组织生成。术后8、12周，A组骨缺损区材料基本吸收，缺损区被骨组织取代；B组与C组见缺损区有新骨形成，但硬度不高，仍见少量材料残留；D组见大量纤维组织，未见成骨形成。

2.3 X线片检查结果

术后2周，3组缺损区清晰可见，差别不明显。术后4周时，A组缺损区有少量骨痂形成，材料与周边组织接触紧密，边界模糊，密度低于正常骨；B组缺损边界仍清晰，材料无明显变化；C组缺损区材料阻射影清楚，低密度影多；D组边界清晰，低密度影明显。术后8周，A组缺损区材料吸收，边界模糊，高密度区面积增多，边界尚清；B组缺损区可见絮状高密度影，骨密度较低，与周围界限尚清；C组低密度影明显与周围界清；D组界清，大片低密度影，缺损区内密度值明显低于正常。术后12周，A组缺损区材料基本吸收，边界模糊不清，材料与骨有骨性连接，其与组缺损区边界不清但仍可见，边缘与骨质有带状低密度影；B组优于C组；D组缺损区边界尚清，未见高密度影形成（图3）。

2.4 组织学观察结果

术后2、4周时，A组可见大量纤维骨痂，成骨细胞形成，材料略有减少；其余3组可见多生肉芽组织，材料与骨质仍界清。术后8周时，A组材料吸收明显，有新生骨长入，大量成骨细胞，材料内有纤维组织生成，骨小梁排列不规则；B组见骨痂形成明显，材料有少量吸收；C组残存材料明显；D组见大量成纤维组织和炎性肉芽组织，未见成骨。12周时，A组材料基本吸收，大量纤维骨痂组织生成骨组织，骨小梁排列紧密规则，密度增大；B组成骨小于A组，骨小梁较少，材料仍有部分残留，骨小梁排列不规则，可见新的纤维骨痂生成；C组成骨不如B组；D组纤维增生明显（图4）。

2.5 SEM观察结果

2周时，4组缺损区材料均与周围骨界限有裂隙。术后4周时，A组材料与骨组织结合，二者之间结合紧密，有大量胶原纤维组织长入材料，骨痂生成明显，其余3组材料与周围骨质界限清晰，结合仍有裂隙，有少量胶原纤维长入。术后8、12周，A组材料与骨质界限不清，形成大量新生骨，材料基本吸收；B组纤维组织向材料中心长入，材料周围有钙化；C

组在缺损边界钙化；D组未见硬化组织，缺隙明显（图5）。

2.6 统计分析结果

通过对各时间段4组骨缺损区修复CT值测量结果比较分析可见：A组与其他3组两两比较，其CT值明显高于其他3组，差异有统计学意义（P<0.05）。通过对各时间段4组新生骨面积占骨缺损面积的百分比测量结果比较分析可见：A组与其他3组两两比较，其新生骨面积明显高于其他3组，差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。

3 讨论

当今社会中，由于炎症肿瘤外伤等原因所致颌骨缺损患者的数量一直居高不下，而颌骨由于其解剖和功能上的特殊性，其缺损的修复一直是口腔颌面外科研究的热点之一[8]。

骨缺损的修复方法有很多，随着当代骨组织工程和细胞分子生物工程的迅猛发展，种子细胞复合支架材料成为骨缺损修复研究进程中的主要热点之一[9-11]，骨髓间充质干细胞是早期研究的种子细胞之一[12-14]，其成骨作用明显受到重视，但由于其来源匮

乏，制约了其在临床上的应用。近年来ADSCs作为新的种子细胞来源出现在人们面前[15-17]，其本身所具有的取材容易、安全性高、获取率高、自我更新速

度快和多向分化等优点成为新的研究热点。

本实验通过ADSCs的制备、分离培养及扩增，并将其接种于载杜仲醇提取物的支架材料上，通过杜仲促进ADSCs向成骨细胞的诱导分化刺激成骨，具有良好的生物安全性和生物相容性。结合本实验的研究过程和实验结果，发现A组成骨效果明显优于其他3组。影像学观察发现：在8周时，A组材料的吸收比较明显，成骨边界模糊不清；B、C组只有一定降解；D组界清，大片低密度影。组织学观察发现：在12周时，A组材料基本降解，骨质成熟，骨小梁排列整齐；B组成骨小于A组，骨小梁较少，排列不规则；C组成骨不及B组；D组纤维增生明显。SEM观察发现：在12周时，A组已有良好新骨生成，材料降解完成，并与骨组织结合紧密；B组只有少量骨痂形成；C组见大量纤维组织，边缘钙化严重；D组缺隙明显，未见硬组织生成。最后经过影像学数据及计算机图像分析结果进行统计学意义上的分析得到各组新生骨及骨密度均有增加，但A组明显优于其他3组，A组材料具有较高成骨性能，具有加速成骨的作用。

目前大量的研究成果证明种子细胞在骨科领域有着巨大前景，其成骨分化潜能和多向分化能力使其与支架材料复合后成功应用于动物骨缺损修复过程中[18-20]。本实验以ADSCs为种子细胞复合载杜仲醇

提取物支架材料修复兔下颌骨缺损，研究证实了杜仲醇提取物对ADSCs成骨的诱导作用及其复合材料应用于颌骨缺损中的良好生物相容性和修复可行性，但复合材料的最适宜比例和移植后相关影响因素尚不十分清楚，有待于进一步研究。

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（本文编辑 杜冰）