里氏木霉发酵法制备纤维素酶粗酶液及其酶促打浆的应用

张正健，韩雨彤，陈蕴智，胡惠仁

(1. 天津科技大学包装与印刷工程学院，天津 300222；2. 天津市制浆造纸重点实验室，天津科技大学材料科学与化学工程学院，天津 300457)

1 材料与方法

1.1 原料与仪器

里氏木霉(Trichoderma reesei)DWC11，天津科技大学微生物实验室提供；思茅松 BKP，云南云景林纸股份有限公司提供．羧甲基纤维素钠(CMC)、无水葡萄糖、乙酸钠、硫酸镁、冰醋酸、硫酸锰、盐酸、磷酸二氢钾、硝酸钠、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、3，5-二硝基水杨酸(DNS)、氢氧化钠、硫酸、亚硫酸氢钠、苯酚、氯化钴、氯化钙、氯化锌、氯化钾、硫酸亚铁、酒石酸钾钠、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、硫酸铵、硝酸铵、尿素、微晶纤维素、蔗糖、麦芽糖、麸皮、麦秆粉、柠檬酸钠、柠檬酸、水杨素，市售．

恒温培养箱，江苏正基仪器有限公司；恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；高速冷冻离心机，日本日立公司；高压灭菌锅，上海申安医疗器械厂；紫外分光光度计，LabTech公司；Valley打浆机，陕西科技大学机械厂；真空泵，郑州长城科工贸有限公司；PFI磨，挪威制浆造纸研究院；肖伯氏打浆度仪，宜宾造纸厂；快速纸页成形器，EStanit Gbmh公司；抗张强度测试仪、撕裂度测试仪、耐破度测试仪，Lorentzen & Wettre公司．

1.2 培养基和相关溶液的配制

1.2.1 培养基

里氏木霉试管斜面培养基：1,g CMC、4,g营养元素液、0.1,g微量元素液、2,g琼脂，加入蒸馏水至总质量为 100,g，pH 6.0．里氏木霉种子发酵培养基：1,g葡萄糖、4,g营养元素液、1,g麸皮、0.1,g微量元素液，加入蒸馏水至总质量为100,g，pH 5.5～6.0．里氏木霉基础发酵培养基：1,g麸皮、4,g营养元素液、0.2,g微量元素液、1,g碳源，加入蒸馏水至总质量为100,g．

1.2.2 相关溶液的配制

营养元素液：6.25,g柠檬酸钠、12.5,g磷酸二氢钾、5,g硫酸铵、1,g硫酸镁和 0.5,g氯化钙溶解后定容至100,mL．微量元素液：2.5,g硫酸亚铁、0.98,g硫酸锰、0.83,g氯化锌、1,g氯化钴和 5,mL 2,mol/L HCl溶解后定容至100,mL．

1.3 实验方法

在温度 30,℃、摇床转速 120,r/min条件下培养96,h，通过改变氮源和碳源种类、碳源加入量、麸皮加入量、微量元素液加入量和营养元素液加入量，以发酵粗酶液的吸光度为评价依据，系统考察上述各种条件变化对纤维素酶各组分酶活的影响．在考察加入量对产酶的影响时，其加入量是相对于培养基总量(含自身)的质量百分比．在一定温度和 pH 条件下，1,mL酶液(1,g酶粉)每分钟水解相应底物产生 1,µg还原糖(以葡萄糖计)的酶量定义为 1个酶活单位．滤纸酶活(FPA)表示酶的总体活性、Cx酶活表示内切葡萄糖苷酶活性、C1酶活表示外切葡萄糖苷酶活性、Cb酶活表示 β-葡萄糖苷酶活性，对应的降解底物分别为 1,cm×6,cm 的滤纸、1% CMC溶液、50,mg脱脂棉球和 1%水杨素溶液．取一定量稀释酶液，与相应底物反应一定时间，反应液经 DNS显色，测定530,nm的吸光度，根据标准曲线(以葡萄糖为标准物)确定还原糖产生的量，从而确定出酶的活力，吸光度越大，表明酶活性越强．通过改变酶用量，考察其对打浆性能和纸浆物理性能的影响，具体方法见参考文献[7]．

2 结果与讨论

2.1 里氏木霉发酵培养条件对产酶的影响

2.1.1 氮源和碳源种类

1995年，建设部印发了《城市园林绿化企业资质管理办法》和《城市园林绿化企业资质标准》，将园林绿化企业自此从建工企业中分离。2007年，建设部印发了《工程设计资质标准》，又将风景园林工程从市政公用行业脱离出来。2011年3月，风景园林学被批准为国家一级学科，与城乡规划学、建筑学形成三足鼎立之势，风景园林行业的地位产生了巨大提升。但目前的城乡园林绿化法规大多仍然设置在城市市政公用事业规体系之下，在生态文明建设日益重要的今天，缺乏一定的独立性。

氮源和碳源种类对产酶的影响如图 1所示．由图 1(a)可以看出，氮源不同对各组分酶活有显著影响，无机氮源以硫酸铵为最佳，有机氮源以牛肉膏为最佳．产酶高低依次是硫酸铵＞牛肉膏＞硝酸铵＞蛋白胨＞酵母膏＞尿素．以尿素为氮源，酶活很低，这是由于尿素使液体培养基的pH增加所致．硫酸铵所对应的各组分酶活都较高，并且价格较低，原料易得，故采用硫酸铵为培养基的氮源．

从图 1(b)中可以看出，固体碳源的产酶效果要比可溶性碳源好，这是因为纤维素酶是诱导酶，受碳源种类的影响较大，纤维材料能够产生更好的诱导效果．当采用思茅松 BKP和微晶纤维素为碳源时，各组分酶活都比以麦秆和碱处理麦秆为碳源时要高，这是因为麦秆和碱处理麦秆的木素和半纤维素含量高，阻碍了里氏木霉菌体与纤维的接触，因此其产纤维素酶活性较低．由于本发酵所制纤维素酶最终目的是用于思茅松 BKP的酶促打浆研究，所以为了能够获得针对性更强的纤维素酶，本研究采用思茅松 BKP为发酵碳源．

图1 不同氮源和碳源对产酶的影响Fig.1 Effect of different nitrogen and carbon sources on cellulase production

2.1.2 碳源加入量

碳源加入量对产酶影响较大，如果加入量过低，则不能够提供菌体生长所需要的碳源量；如果加入量过高，会导致发酵液的固含量过高，不易摇动起来，从而导致溶氧量不足，菌体无法正常生长，最终使得产酶活性较低．碳源加入量对产酶的影响如图 2所示．

图2 碳源加入量对产酶的影响Fig.2 Effect of carbon source dosage on cellulase production

从图 2中可以看出，当思茅松 BKP加入量为0.5%～1%时，FPA 和 C1酶活相对较高，当思茅松BKP加入量大于1%时，FPA和C1酶活明显降低；当思茅松BKP加入量为0.5%～3%时，Cb和Cx酶活相对较高，当思茅松 BKP加入量大于 3%时，Cb和 Cx酶活迅速降低．这表明 FPA和 C1酶活受思茅松BKP加入量的影响较大，而Cb和Cx酶活受其影响较小．当思茅松 BKP加入量为 1%时，各组分酶活都达到最大值，因此本研究采用的思茅松 BKP加入量为1%．

2.1.3 麸皮加入量

麸皮加入量对产酶的影响如图 3所示．可以看出，当麸皮添加量为 1%时，各组分酶活均达到最大值，随着其加入量的继续增加，活力反而逐渐下降，这说明麸皮添加量过大对发酵不利，因此在发酵过程中添加1%的麸皮来提高发酵产酶活力．

图3 麸皮加入量对产酶的影响Fig.3 Effect of bran dosage on cellulase production

2.1.4 微量元素液加入量

微量元素液含有 Fe2+、Mn2+、Zn2+和 Co2+，这些金属离子在一定的浓度下对纤维素酶的合成以及酶活性有促进作用，比如Fe2+离子在酶与底物之间起着连桥作用，从而更有利于底物与酶的活性中心必需基团的结合．但是，如果上述离子浓度过大，则对产酶有抑制作用．微量元素液加入量对产酶的影响如图 4所示．

图4 微量元素液加入量对产酶的影响Fig.4 Effect of microelement liquid dosage on cellulase production

从图中可以看出，当微量元素液用量为 0.2%时，各组分酶活都达到最大，大于或小于 0.2%都对产酶不利，因此确定发酵培养基中的微量元素液加入量为0.2%．

2.1.5 营养元素液加入量

营养元素液中包含发酵所必需的氮源(硫酸铵)、磷酸氢二钾-柠檬酸钠缓冲溶液、Mg2+和 Ca2+．由于微生物在代谢过程中不断地向培养基中分泌代谢产物，影响培养基的pH变化，对大多数微生物来说，主要产生酸性产物，所以在培养过程中常引起 pH的下降，影响微生物的生长繁殖速度．为了尽可能地减缓培养过程中 pH的变化，在配制培养基时，加入一定的缓冲物质可以起到调节pH的作用．营养元素液中的钾、钙和镁离子还参与细胞结构物质的组成，并有能量转移、细胞透性调节等功能．营养元素液用量对产酶的影响如图5所示．

图5 营养元素液用量对产酶的影响Fig.5 Effect of nutrition element liquid dosage on cellulase production

由图 5可知，随着营养元素液用量的增加，纤维素酶各组分酶活先上升后下降，在用量为 8%时均达到最高值．当用量小于 8%时，不能满足菌体的生长所需，但是用量过大时则对产酶有抑制作用．因此确定发酵培养基中的营养元素液加入量为8%．

2.2 酶促打浆

在氮源(硫酸铵)0.2%、碳源(思茅松 BKP)1%、麸皮 1%、微量元素液 0.2%、营养元素液 8%，温度30,℃、摇床转速 120,r/min条件下发酵培养 96,h，其各组分酶活为：FPA 酶活 471.42,U/mL，Cx酶活3,083.19,U/mL，C1酶活 471.42,U/mL，Cb酶活为27.79,U/mL．通过改变酶用量，研究其在酶促打浆中的作用．

酶用量(按 FPA 酶活计算，下同)对纸浆打浆度和物理性能的影响见表 1．从中可以看出，在打浆时间均为 4,min的条件下，当酶用量在 0～5,U/g之间时，打浆度增加较平缓；酶用量大于5,U/g时，打浆度明显上升，酶用量为 7,U/g时，打浆度比空白样高出10,°SR．打浆度的增加是由酶解作用造成的．酶解作用使纸浆纤维细胞壁的结构受到破坏，使纤维产生内部和外部细纤维化，从而使其易于打浆．在相同打浆时间内，酶处理后的浆样比空白样的打浆度要高，酶用量越大提高程度越大，即在达到相同打浆度的情况下，酶处理后的浆样能有效降低打浆时间，酶用量越大所需的打浆时间就越少，从而降低打浆能耗．

表1 酶用量对打浆和纸浆物理性能的影响Tab.1 Effect of cellulase dosage on beating degree and the pulp physical properties

在研究酶用量对纸浆物理性能的影响时，空白样和酶处理样都需达到同一打浆度，即控制在48,°SR．纸浆的物理性能的变化是纤维间结合力、纤维内在强度和纤维平均长度综合影响的结果．从表 1中可以看出，抗张指数只在酶用量为 5,U/g时略有增加；耐破指数和撕裂指数随着酶用量增加都呈逐渐下降趋势，但下降的幅度都不大．因此，采用里氏木霉自制纤维素酶进行酶促打浆，不仅能够有效地提高打浆性能，而且还能够最大程度地保持纸浆的强度性能，这对降低酶促打浆生产成本、推广其工业化应用具有一定实用价值．

3 结 论

里氏木霉发酵制备纤维素酶粗酶液的发酵培养条件如下：氮源(硫酸铵)0.2%、碳源(思茅松BKP)1%、麸皮 1%、微量元素液 0.2%、营养元素液8%，温度 30,℃、摇床转速 120,r/min，培养 96,h．随着里氏木霉所制纤维素酶用量的增加，打浆度逐渐上升，思茅松 BKP的打浆性能得到明显提高；纸浆的物理强度性能有所下降，但下降幅度不大．

［1］ 张继泉，王瑞明，孙玉英，等. 里氏木霉生产纤维酶的研究进展[J]. 饲料工业，2003，24(1)：9–13.

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［3］ 胡彩静，代淑梅，李秋园. 里氏木霉(Trichoderma reesei)产纤维素酶液态发酵条件的研究[J]. 食品与发酵工业，2005，31(9)：45–48.

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