梨腐烂病致病力的室内快速测定方法研究

张美鑫 翟立峰等

摘 要： 【目的】为了研究建立我国梨腐烂病致病力室内快速、稳定的测定方法，【方法】以‘丰水梨的离体枝条、叶片、嫩梢和果实为材料，采用不同方法造成伤口后接种梨腐烂病的强致病力菌株F-AH-3a，在25 ℃下保湿培养后观测各处理的发病程度，并在‘丰水梨和‘康德梨上用梨腐烂病致病力已知的菌株对测定方法进行验证。【结果】叶片伤口接种，叶正面的病斑较背面的大，经6针与1和3针刺伤处理产生的病斑大小之间存在显著性差异；嫩梢和果实伤口接种，不同处理产生的病斑大小之间无显著性差异；枝条伤口接种3d后，经打孔、环割、烫打及10针刺伤处理的枝条发病率均为100%，而经3针刺伤、烫伤和芽痕处理的分别为55%、40%和15%。前4种处理病斑的长度显著大于后3种处理。在‘丰水梨和‘康德梨品种上，用5个梨腐烂病致病力已知菌株对测定方法进行验证的结果表明，各菌株通过枝条打孔接种后产生的病斑，在其长度之间的差异与菌株致病力已知的强弱相吻合。【结论】采用枝条打孔接种法的测定效果显著、稳定，且操作简单，可用于梨腐烂病菌致病力的室内快速测定。

关键词： 梨腐烂病； 致病力； 室内测定； 枝条打孔接种

中图分类号：S661.2 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪02-0317-06

梨腐烂病主要危害主干、主枝及侧枝，造成树皮腐烂，其症状有溃疡和枝枯2种类型[1]。该病在我国各梨区均有分布，尤以东北、华北和西北梨区危害较重，常造成大量死树，甚至毁园。梨园腐烂病的发生数量和危害程度与梨系统和品种关系密切，秋子梨（Pyrus ussuriensis Maxim.）基本不发病，白梨 （P. bretschneideri Rehd.）、沙梨 （P. pyrifolia （Burm.f.） Nakai ）和新疆梨 （P. sinkiangensis Yü）较感病，西洋梨（P. communis L.）发病最重[2-3]。梨和苹果腐烂病系由同一病菌的两个变种所致，即梨腐烂病菌（Valsa mali var. pyri） 和苹果腐烂病菌（V. mali var. mali）所致[4]，但目前我国对梨腐烂病的研究远没有苹果腐烂病广泛和深入，对来源于不同梨种类和不同梨产区的梨腐烂病菌致病力分化特征尚缺乏系统研究，而建立可靠的致病力测定方法是其研究关键。虽然有报道苹果腐烂病可在室内利用针刺接种苹果叶片或烫伤接种苹果枝条测定其致病力[5]，但因梨腐烂病与苹果腐烂病的病原不同[4]，2者在同一寄主和不同寄主上的致病反应均存在明显差异，且生产上梨的栽培范围和栽培种类较苹果更为广泛和繁多，梨腐烂病菌致病力的分化可能更为复杂，因此需要对梨腐烂病菌致病力的测定方法进行系统研究。

我们以‘丰水梨的离体枝条、叶片、嫩梢和果实为材料，采用不同方法造成伤口后接种梨腐烂病菌的强致病力菌株，观测各处理的发病程度，并在‘丰水梨和‘康德梨上用梨腐烂病致病力已知的菌株对测定方法进行验证，旨在建立梨腐烂病菌室内快速、稳定且操作简单的测定方法，为深入研究我国梨腐烂病菌致病力分化、抗性资源评价及防治药剂筛选奠定技术基础。

1 材料和方法

1.1 供试菌株和接种材料

依据在2 a生‘丰水梨（Pyrus pyrifolia ‘Hohsui）上用梨腐烂病菌株进行活体接种的试验结果，选取5个致病力已知的菌株： F-HN-6（强致病力菌株）、F-AH-3a（强致病力菌株）、F-LN-5a（中致病力菌株）、F-SHX-1b（中致病力菌株）和F-HN-2a-1（弱致病力菌株）作为本研究的供试菌株。

从华中农业大学梨园中的‘丰水梨和‘康德梨（Pyrus communis ‘Le Counte）上分别选取长短均匀、含水量一致的1 a生健康枝条、3周龄以上完全展开叶片、1 a生枝条顶端未木质化的嫩梢和成熟的果实作为本研究的接种材料。

1.2 接种方法

1.2.1 枝条伤口接种 枝条用无菌水洗净晾干，经75%酒精消毒后将其剪成15 cm小段，两端用石蜡封口。伤口处理设有： 无伤、芽痕（用灭菌的解剖刀抹去芽）、3和10针刺伤（用灭菌的解剖针刺伤树皮，针点均匀分布在直径5 mm的圆形区域）、烫伤（用烧热的直径5 mm的铁钉钉帽烫伤）、烫打（用烧热的直径5 mm打孔器取下树皮韧皮部）、打孔（用灭菌的直径5 mm打孔器取下树皮韧皮部）、环割（用灭菌的解剖刀环割枝条1周）。梨腐烂病强致病力菌株F-AH-3a在PDA培养基上培养2 d后，用5 mm打孔器从最外缘打取菌丝块，分别接种于以上伤口处，并在菌丝块上面覆盖滴有无菌水的脱脂棉保湿，以空白PDA培养基接种作为对照。接种后的枝条置于白盘中（盘底铺滴有无菌水的灭菌纱布，盘口覆保鲜膜），在25 ℃条件下培养4 d后测定其病斑的长度。每一接种处理重复6次，试验重复3次。

1.2.2 叶片伤口接种 叶片用无菌水洗净晾干，叶柄处用滴有无菌水的脱脂棉保湿，伤口处理设有： 正面无伤、1、3、6和10针刺伤；背面无伤、1、3、6和10针刺伤。菌株、接种方法、对照设置、病斑测定和重复次数同上。

1.2.3 嫩梢伤口接种 嫩梢长约15 cm，剪去叶片（留一部分叶柄），无菌水洗净晾干，剪口处用滴有无菌水的脱脂棉保湿。伤口处理设有： 无伤、1针刺伤和叶痕。菌株、接种方法、对照设置、病斑测定和重复次数同上。

1.2.4 果实伤口接种 果实用无菌水洗净晾干，75%酒精消毒，伤口处理设有： 无伤、烫伤、1、3和10针刺伤、打孔。菌株、接种方法、对照设置、病斑测定和重复次数同上。

1.3 数据统计分析

统计数据采用SPSS.16.0软件进行分析， 处理间的差异显著性采用Duncans Multiple Range Test。

2 结果与分析

2.1 不同方法对强致病力菌株的测定结果

2.1.1 枝条接种法的测定结果 枝条上无伤口接种F-AH-3a和空白培养基接种均未发病。有伤枝条接种F-AH-3a ，接种2 d后在伤口处开始出现黄褐色病斑，病健交界明显，之后逐渐形成外围黑色、中间黄褐色的轮纹状褶皱病斑，且发病部位向下凹陷（图版A1～A8）。其中接种3 d时的发病率，经打孔、环割、打烫和10针刺伤处理的均为100%，烫伤处理的为40%，3针刺伤处理的为55%，芽痕处理的为15%。接种7 d后整个枝条软化腐烂，并开始形成黑色分生孢子器，接种20 d后有黄色分生孢子角泌出。

对枝条经不同伤口接种4 d后的病斑长度统计分析的结果显示经10针刺伤、烫打、打孔和环割四种处理的病斑长度明显大于烫伤、3针刺伤和芽痕3种处理的病斑长度，其差异性显著，但前四种处理的病斑长度之间无显著性差异。

2.1.2 叶片接种法的测定结果 叶片上无伤口接种F-AH-3a和空白培养基接种均未发病。有伤口叶片接种F-AH-3a，接种1 d后针孔处均变褐色，且经6针刺伤和10针刺伤处理的病斑超出菌饼，之后病斑逐渐变黑，形成中间黄褐色，外围黑色与黄色交替的轮纹近圆形病斑（图版B1～C5）。在叶片正面接种产生的病斑较在背面接种产生的病斑大。接种5 d后叶片上开始形成黑色的分生孢子器，孢子器上面覆盖有白色的菌丝，之后分生孢子器数量逐渐增加，接种10 d后出现黄色的分生孢子角。

对叶片经不同伤口接种2 d后的病斑直径统计分析的结果显示经6针和10针刺伤处理产生的病斑直径较大，与1针和3针刺伤处理产生的病斑在直径大小上存在显著性差异，但在叶片正面接种产生的病斑与在叶片背面接种产生的病斑在直径大小上不存在显著差异性。

2.1.3 嫩梢接种法的测定结果 嫩梢上无伤口接种F-AH-3a和空白培养基接种均未发病。有伤口嫩梢接种F-AH-3a，接种12 h后经1针刺伤处理的嫩梢能够看到黑色病斑，但病斑未超出菌饼，经叶痕处理的嫩梢在接种处变褐，病斑无扩展，接种1 d后经1针刺伤与叶痕处理的嫩梢均出现黑色病斑，且病斑超出菌饼。之后病斑逐渐扩大，使整个嫩梢变黑腐烂。接种7 d后嫩梢上出现分生孢子器，其上覆盖大量白色菌丝，接种12 d后有黄色分生孢子角泌出。

对嫩梢经不同伤口接种2 d后的病斑长度统计分析的结果显示经针刺处理与叶痕处理的病斑长度相近，不存在显著性差异。

2.1.4 果实接种法的测定结果 果实上无伤口接种F-AH-3a和空白培养基接种均未发病。有伤口果实接种，接种12 h后经1针刺伤、3针刺伤和10针刺伤处理的均在针刺处出现黄色病斑，但经打孔和烫伤处理的未观察到病斑。接种1 d后经各种伤口处理产生的病斑均超出菌饼，病斑圆形，外缘黑色、中间黄色。接种4 d后果实组织软化，接种7 d后果实开始腐烂，但一直未出现分生孢子器。

对果实经不同伤口接种2 d后的病斑直径统计分析的结果显示经各种处理产生的病斑在直径大小相近，不存在显著性差异。

2.2 用致病力已知菌株对测定方法的验证结果

在‘丰水梨上，采用5个致病力已知的梨腐烂病菌株对4种接种方法进行验证的结果显示，除空白培养基接种未发病外，5个菌株均产生大小不同的病斑（图版D1～D6）。在枝条、嫩梢和叶片上2个强致病力菌株F-HN-6和F-AH-3a所产生的病斑最大，其病斑差异不显著；2个中致病力菌株 F-LN-5a和F-SHX-1b所产生的病斑大小次之，弱致病力菌株F-HN-2a-1所产生的病斑最小。在枝条和叶片上，强、中、弱致病力菌株所产生的病斑大小之间差异显著。在嫩梢上，中与强致病力菌株所产生的病斑大小之间差异不显著。在果实上，弱致病力菌株所产生的病斑最大，与该菌株实际的毒力大小不相符合（表1）。

在‘康德梨上，采用5个致病力已知的梨腐烂病菌株对4种接种方法进行验证的结果显示，除空白培养基接种未发病外，5个菌株均产生大小不同的病斑（图版E1～E6）。在枝条、嫩梢和叶片上，2个强致病力菌株F-HN-6和F-AH-3a所产生的病斑最大，其病斑大小差异不显著；2个中致病力菌株 F-LN-5a和F-SHX-1b所产生的病斑大小次之；弱致病力菌株F-HN-2a-1所产生的病斑最小。在枝条和嫩梢上，强、中、弱致病力菌株所产生的病斑大小之间差异显著。在叶片上，中与强致病力菌株所产生的病斑大小之间差异不显著。在果实上，弱与中和强致病力菌株所产生的病斑大小之间差异不显著，这与弱菌株的实际毒力大小不相符合（表2）。

3 讨 论

果树（梨、苹果、山楂、桃、杏）和林木（桉树、杨树、柳树、槐树）腐烂病的病原菌均为弱寄生菌，在田间通过伤口（剪锯口、裂口、日灼、冻伤）侵入树体，因此腐烂病菌致病力的测定，不论是田间活体接种，还是室内离体材料接种，均需在接种部位造成伤口。伤口类型、接种部位和接种材料的不同均可影响到病原菌致病力的测定结果。

Adams等[6]利用枝条烫伤接种法对桉树腐烂病菌的致病力进行了测定，Abe等[7-8]通过在枝条上烫伤后接种苹果腐烂病菌进行苹果抗性种质资源的筛选和评价，臧瑞等[9]利用枝条烫伤接种法证实陕西地区的苹果腐烂病菌存在不同致病力的菌株。韦洁玲等[5]利用苹果的不同组织材料对苹果腐烂病菌不同致病力菌株进行验证，发现嫩梢、叶片和果实的测定结果与枝条烫伤接种法的结果一致。但Bessho等[10]研究认为烫伤时间的一致性很难把握，而烫伤时间上的差异对其测定结果影响很大。Bessho等[11]通过在苹果枝条上造成楔形伤口接种病菌菌丝块鉴定种质资源对苹果腐烂病的抗性，刘欣颖等[12]通过枝条打孔法接种苹果腐烂病菌分生孢子悬浮液评价苹果种质资源对苹果腐烂病的抗性。

梨腐烂病与苹果腐烂病的病原在rDNA-ITS核苷酸序列、培养特征和致病特性上均存在差异，已有研究发现苹果腐烂病菌（V. mali var. mali） 仅侵染苹果，而梨腐烂病菌（Valsa mali var. pyri） 可侵染梨和苹果[4]，本实验室从我国15个梨产区采集的腐烂病样品中分离获得的168个菌株经鉴定均为梨腐烂病菌，未鉴定出苹果腐烂病菌，并发现在‘翠冠梨枝条上梨腐烂病菌的致病力强于苹果腐烂病菌，而在‘富士苹果枝条上苹果腐烂病菌的致病力强于梨腐烂病菌株[13]。但有关梨腐烂病菌致病力的室内快速测定方法的研究至今尚无报道，对来源于不同梨种类和不同梨产区的梨腐烂病菌致病力分化特征也缺乏系统研究。

本研究在‘丰水梨不同组织材料上采用不同接种方法对梨腐烂病强致病力菌株所产生的病斑大小进行了测定，并在‘丰水梨和‘康德梨上用梨腐烂病致病力已知的菌株对不同测定方法进行了验证。研究结果表明，梨腐烂病菌室内致病力测定的效果因接种材料和伤口处理方式的不同存在显著差异。采用1 a生枝条作为接种材料时，不同菌株在2个接种品种上所产生的病斑大小之间差异显著，均与田间活体接种结果一致；采用3周龄以上完全展开叶片和顶端未木质化的嫩梢，不同菌株所产生的病斑大小之间的差异随接种品种的不同而异；采用成熟的果实，不同菌株产生的病斑大小之间的差异不显著，测定结果与田间活体接种结果不一致，因此选择1 a生枝条作为梨腐烂病菌致病力测定的接种材料。在枝条的伤口处理方式上，经打孔、10针刺伤、烫打和环割4种处理产生的病斑大小之间无显著性差异，但与芽痕、3针刺伤和烫伤法这3种处理所产生的病斑大小之间存在显著性差异，在前4种处理中枝条打孔操作简单，故选其为梨腐烂病菌致病力测定的伤口处理方式。

当采用枝条打孔接种法测定梨腐烂病菌致病力的强弱时，为保证其测定结果的准确性，根据本试验的研究，需对接种体、接种枝条和培养条件进行选择和控制。在我们的前期预备试验中，在梨枝条上多次采用梨腐烂病菌的分生孢子悬浮液进行活体和离体接种，结果发病率均很低，因此接种体以选取PDA培养基最外缘病菌生长最旺盛的菌丝块为宜。接种枝条则需选取梨同一品种同株树上长势相同的1 a生健康枝条，剪成长短均匀的小段，两端用石蜡封口，使其含水量保持一致。此外，伤口接种后的培养需在保湿控温条件下进行。即在接种的菌丝块上面覆盖滴有灭菌水的脱脂棉保湿，将已接种的枝段置于白塑料盘中培养，盘底铺上滴有无菌水的灭菌纱布，盘口用保鲜膜封闭。培养温度控制在25 ℃。梨腐烂病菌致病力室内测定方法的建立，可为进一步深入研究我国不同梨产区和不同梨种类上腐烂病菌致病力的分化状况和梨对腐烂病的抗性资源及防治药剂的筛选奠定技术基础。

4 结 论

本研究根据‘丰水梨叶片、嫩梢、枝条和果实通过不同伤口接种梨腐烂病强致病力菌株所产生病斑长度的测定结果，以及在‘丰水梨和‘康德梨上用致病力已知的梨腐烂病菌株对测定方法的验证结果，认为采用枝条打孔接种法，测定效果显著、稳定，且操作简单，可用于梨腐烂病菌致病力的室内快速测定。（本文图版见封3）

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