海南省和河南省发生甜瓜褪绿黄化病的分子鉴定

刘珊珊 彭斌等

摘 要：【目的】为了探明引起海南省和河南省甜瓜褪绿黄化的病因，【方法】提取从海南三亚和河南郑州采集的甜瓜叶片的RNA，用CCYV特异性引物进行外壳蛋白基因的克隆、测序，并与GenBank中同属或同种病毒的cp基因核苷酸序列构建系统进化树。【结果】结果显示，RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，所得条带在880 bp左右，与预期的一致；构建cp基因的系统进化树发现，样品与瓜类褪绿黄化病毒（Cucurbit chlorotic yellows virus，CCYV）的亲缘关系很近，属于同一个分枝，而与该病毒同属不同种的南瓜黄矮失调病毒（Cucurbit yellow stunting disorder virus，CYSDV）和大麦黄矮病毒（Barley yellow dwarf virus，BYDV） 的亲缘关系较远，属于不同的分枝。【结论】证实海南省和河南省甜瓜褪绿黄化病是由瓜类褪绿黄化病毒引起。

关键词： 甜瓜； 瓜类褪绿黄化病毒； 外壳蛋白基因； 黄化

中图分类号：S652 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪02-0291-03

瓜类褪绿黄化病是一种近年爆发的新病害，病原为瓜类褪绿黄化病毒（Cucurbit chlorotic yellows virus，CCYV）。该病毒属于长线病毒科（Closteroviridae）毛形病毒属（Crinivirus），通过烟粉虱以半持久性方式传播，已知在自然界主要侵染葫芦科作物的甜瓜、西瓜、黄瓜。植物感染CCYV后，通常中下部叶片先感染，逐步向上发展，新叶常无症状。叶片开始出现褪绿， 随着病情发展，叶片黄化，同时仍能看见保持绿色的局部组织， 最后全叶黄化，但叶脉仍保持绿色。该病害最早于2004年在日本发现[1]，我国于2007年，在上海、宁波发现，目前已分布于广西、江苏、山东、浙江[2]和台湾[3]，此外该病在苏丹[4]和黎巴嫩也有发生。关于该病害在我国的南北分布仍然不清楚，2011年我们实地调查海南三亚和河南郑州的甜瓜病毒病发生情况，观察到设施甜瓜普遍发生黄化。从发病的大棚采集病叶，通过病毒外壳蛋白基因（cp）的克隆和序列分析，证实样品系CCYV病毒感染。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 样品 2011年3月在海南三亚乐东县佛罗镇长流村、福塘村、莺歌海、尖峰镇；2011年10月在河南郑州河南农业大学实验园区采集表现褪绿黄化的甜瓜叶片，编号分别为SY1、SY2、SY3、SY4和ZZ1，保存于-80 ℃。

1.1.2 试剂 M-MLV反转录酶、dNTPs、RNAiso Plus试剂、TaqDNA聚合酶、Ribonuclease Inhibitor和T载体pMD18-T等分子生物学试剂，产品购自宝生物工程有限公司；75%乙醇（DEPC处理水配制）、氯仿、异戊醇等均为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 植物总RNA的提取 参照TaKaRa RNAiso Plus试剂盒的说明，从所采集的甜瓜叶片中提取总RNA。称取0.2 g样品于干热灭菌的研钵中加液氮研磨，加700 μL的RNAiso Plus后匀浆，静置5 min，12 000 r·min-1、4 ℃离心5 min，取上清加入140 μL的氯仿振荡混匀，静置5 min，12 000 r·min-1、4 ℃离心15 min，取上清并加入等体积的异丙醇，静置10 min，12 000 r·min-1、4 ℃离心10 min。加入1 mL的75%乙醇洗涤沉淀，12 000 r·min-1、4 ℃离心5 min，弃上清保留沉淀，晾干，溶解于30 μL的DEPC处理水中。

1.2.2 cp基因扩增 根据GenBank发表的CCYV的cp序列，设计一对特异性引物CP-F： CGTAAGTGATCGCAATCAAT，CP-R： AGTGATCACTTGACCATCTCC，扩增片段长度876 bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

以提取的总 RNA 为模板进行反转录，反应体系为10 μL。向经过DEPC处理的0.2 mL的离心管中加入3 μL RNA、1 μL CP-R 10 μmol·L-1、3.5 μL dNTPs 25 mmol·L-1、2 μL 5×M-MLV Buffer、0.2 μL的RNA酶抑制剂 40 u·μL-1和0.3 μL的M-MLV反转录酶200 u·μL-1，42 ℃水浴1 h。

PCR反应采用15 μL体系，含ddH2O 7.7 μL、10×PCR缓冲液 1.5 μL、dNTPs 2.5 mmol·L-11 μL、反转录产物2.5 μL、10 μmol·L-1的CP-F和CP-R各1 μL、5 u·μL-1 Taq DNA聚合酶 0.3 μL。反应条件为：94 ℃预变性 3 min；94 ℃ 变性1 min、58 ℃ 退火1 min、72 ℃ 延伸1 min，共30个循环；最后72 ℃总延伸10 min。

1.2.3 目的片段的回收 PCR产物经1%的低熔点琼脂糖凝胶电泳、EB染色后在凝胶成像系统上观察、拍照，用大连宝生物工程有限公司的小量DNA片段快速胶回收试剂盒回收目的片段。

1.2.4 PCR产物克隆 PCR产物回收后与pMD18-T连接，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞。37 ℃培养14～16 h，挑取单菌落，37 ℃ 200 r·min-1培养，3～5 h后PCR鉴定转化结果，转化成功的菌液送到上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.2.5 序列分析 利用DNAMAN软件比较所得序列与GeneBank中CCYV的cp基因序列的相似性。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR结果

采用RT-PCR方法对从河南与海南采集的甜瓜叶片进行检测，经琼脂糖凝胶电泳，结果显示，产物大小在880 bp左右，与预期的一致2.2 核苷酸序列测定与同源性分析

对含有扩增片段克隆的大肠杆菌菌液进行序列测定，获得了SY1、SY2、SY3、SY4和ZZ1 5个CCYV分离物的部分基因组序列。扩增的片段长876 bp，包含完整的cp基因序列（4941～5693nt；753 bp）和部分cpm基因序列（5693～5740 nt；48 bp）。

用DNAMAN将所得的5个分离物的cp基因的核苷酸序列与GenBank中提交的所有CCYV以及该病毒同属的南瓜黄矮失调病毒（Cucurbit yellow stunting disorder virus， CYSDV）和大麦黄矮病毒（Barley yellow dwarf virus， BYDV ）的cp基因核苷酸序列构建系统进化树发现这5个分离物与CCYV的亲缘关系很近，属于同一个分枝，而与CYSDV和BYDV的亲缘关系较远，属于不同的分枝，因此可以确定该病毒是CCYV。

3 讨 论

瓜类褪绿黄化病最早于2004年在日本由Okuda等[1]发现，直到2010年病原才被发布，该病由CCYV引起。2007年秋季，在我国宁波、上海、山东发生甜瓜、西瓜和黄瓜的大面积黄化，通过研究证明这些地区发生的瓜类黄化病原是CCYV[2]。世界上目前已知该病害分布于日本、苏丹、黎巴嫩、中国，在我国分布于广西、江苏、山东、浙江和台湾。由于烟粉虱传播的病毒病害容易大范围、大地域的传播发生，我们认为除上述这些地区外，可能会有更大范围的传播和分布，因此调查中国最南部的海南省和中部的河南省，发现秋季种植的甜瓜均发生大面积黄化，这些黄化的症状和病害发生流行的特点与Gu等[2]报道过的中国沿海省份地区如宁波、上海和山东所发生的瓜类黄化病相同，因此推测是同一种病害。本实验通过对从海南三亚、河南郑州采集的样品进行CCYV cp基因克隆和序列分析，证实CCYV在海南、河南这两省均有发生。

瓜类褪绿黄化病毒由烟粉虱以半持久的方式进行传播，仅由成虫带毒，该病的发生与病害发生地烟粉虱的发生有着很大的关系，病害发生季节与烟粉虱大发生时期相一致。B型和Q型烟粉虱传播该病毒，而Q型烟粉虱传播的作用可能更大，因此对烟粉虱生物型分布的了解将有助于此病害发生地的调查研究。目前还没有发现种子携带该病毒的情况，而该病害的发生季节性非常明显，主要集中在8—10月份，与大多数地区的烟粉虱大爆发时期一致，同时我们观察到春季也有发生，这应该取决于瓜类作物种植的环境，如果是温室周年种植瓜类作物，那么也会引起春季发生该病害。

由于该病害是新突发病害，关于该病害的研究还非常少，加强该病害流行学方面的研究无疑有利于我们控制病害。从该病毒在世界及我国的分布来看，该病害已经在许多地方分布，所以了解该病毒的远距离传播方式对防止该病害进一步蔓延有着重要意义。

本试验结果表明，海南三亚、河南郑州发生瓜类褪绿黄化病，说明该病害可能分布于南至海南北至河南的所有地区。随着病害的蔓延，极可能会在更大的地域分布。因此监测与控制该病害，对于西瓜、甜瓜、黄瓜的产业持续健康发展是非常重要的。

参考文献 References：

[1] OKUDA M， OKAZAKI S， YAMASAKI S， OKUDA S， SUGIYAMA M. Host range and complete genome sequence of Cucurbit chlorotic yellows virus， a new member of the genus Crinivirus[J]. Phytopathology，2010，100（6）： 560-566.

[2] GU Q S， LIU Y H， WANG Y H， HUANGFU W G， GU H F， XU L， SONG F M，BROWN J K. First report of Cucurbit chlorotic yellows virus in cucumber， melon， and watermelon in China[J]. Plant Disease， 2011，95（1）： 73.

[3] HUANG L H，TSENG H H ， LI J T， CHEN T C. First report of cucurbit chlorotic yellows virus infecting cucurbits in Taiwan[J]. Plant Disease， 2010，94（9）： 1168.

[4] HAMED K，MENZEL W，DAFALLA G， GADELSEED A M A， WINTER S. First report of Cucurbit chlorotic yellows virus infecting muskmelon and cucumber in Sudan[J]. Plant disease， 2012，95（11）：1321.