机械力化学方法对大豆分离蛋白提取的影响

邱 岚 高健强

QIU Lan GAO Jian-qiang

（铜仁学院生物科学与化学系梵净山特色动植物资源重点实验室，贵州 铜仁 554300）

(Guizhou Tongren College,The Key Laboratory of Characteristic Animal and Plant Resources of Fanjing Mountain,Tongren,Guizhou 554300,China)

大豆蛋白质是空间结构紧密、二硫键构架牢固的蛋白，酶分子难以打开其表面结构，不能进入蛋白分子内部，使得水解反应难以进行，从而导致大豆酶解产肽率相对较低[1]。对大豆蛋白功能性质进行改善是大豆蛋白分离(SPI)研究的热点，目前大豆分离蛋白分离技术有生物技术、物理技术、化学技术和复合技术[2]。机械力化学反应作为一种机械处理的物理化学方法，是近年来的一个新技术。机械力化学也是化学领域的一个分支,它是粉碎技术不断深入发展的产物[3]。近年来,机械力化学技术被广泛应用于无机非金属材料和金属材料加工领域[4]。机械力化学反应是固体物质在各种形式的机械能作用下所激发的化学变化和物理化学变化，以此来制备新材料或对材料进行改性处理[5，6]。物料经机械化学应力的作用，可对某些天然生物资源的理化性能、功能特性和食用特性产生多方面的影响[7]。研究机械化学反应力作用对提高大豆分离蛋白产率具用实际意义。

前人[8～10]在软饮料加工和中草药制备改性应用中研究机械化学反应力的应用的比较多。目前，利用机械化学反应力技术已经开发出的软饮料和中草药有：豆类固体饮料[11]、粉茶[12]、魔芋保健粉[13]、复方贝母散[14]等。经过机械化学反应加工制备后的物料，具有小粒径、大比表面积，在物理、化学等反应过程中，大大增加了反应接触的面积，进而提高了有效的成分提取和浸提过程的化学反应速率，生产过程既节约时间又提高效率[15～17]。因此，通过机械化学应力作用改变大豆分离蛋白的物理化学性质，在大豆分离蛋白降解中应用，具有一定的应用价值。

1 材料与方法

1.1 供试材料

高温脱脂大豆粕：蛋白质47.346%，水分9.464%，脂肪0.429%，灰分3.957%，市售；

HCl:分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

NaOH:分析纯，华东医药试剂有限公司；

纯水、蒸馏水：实验室Millipore纯水机自制。

1.2 仪器与设备

扁平式超音速气流粉碎系统：QLFS-100型，常州市益球中亚干燥设备厂；

粉碎机:RT-300型,荣聪精密科技有限公司;

微粉机:BFM-T6BI型,济南贝利粉碎技术工程有限公司;

恒温磁力搅拌器:79-1型,江苏国胜电器有限公司;

分析天平：HR-200型，上海方瑞仪器有限公司；

离心机：CR-21G型，日立工机株式会社；

恒温水浴锅：HH.S21-4型，上海百典仪器设备有限公司；

pH计：PHS-3E型，上海雷磁有限公司；

分光光度计：U-2010型，日立工机株式会社；

测量显微镜：107JPC型，上海光学仪器厂；

凯氏定氮仪：2100型，瑞典FOSS公司；

恒温水浴振荡器：SHAB型，金坛市国旺实验仪器厂；

激光粒度分析仪：BT-9300H型，丹东百特科技有限公司；

扫描电子显微镜：JSM-6301F型，日本JEOL公司。

1.3 试验方法

机械力化学方法制备大豆粉体的方法：取高温大豆粕,在50～60℃下干燥，进行不同粉碎程度的处理，得到以下3种不同粒度的荷叶样品,备用。试验分为3个处理，每处理3个重复。

(1)样品1：干燥的粗样品经取一定量高温大豆粕用RT静音粉碎机粉碎,过180μm筛,得到的粉体称为粗粉；

(2)样品2：对样品1在QLM扁平式超音速气流粉碎系统粉碎至中位径D50=30μm；

(3)样品3：对样品1在BFM-T6BI“贝利”微粉机粉碎至中位径D50=10μm。

大豆分离蛋白采取碱溶酸沉法工艺[18,19]：

高温脱脂豆粕→清理→一次碱溶→二次碱溶→固液分离→酸沉→离心分离→酸碱调节→浓缩→浓缩干燥

具体提取方法步骤[20]：第一次碱溶料液比1∶12(m∶V)，浸提液浓度1mol/LNaOH，调pH值至9.0，搅拌15min，静置30min；第二次碱溶料液比1∶8(m∶V)，浸提液浓度1mol/L NaOH，调 pH值至 9.0，搅拌 15min，静置 30min；酸沉，浸提液浓度1mol/LHCl，调pH值4.5，停止搅拌，静置30min。

1.4 测定方法

1.4.1 粉体特性 取样品适量，加一定量无水乙醇分散，用滴管移取少量于装有无水乙醇比色皿中，置BT-9300H型激光粒度分布仪测定粒径分布及比表面积；JCM-6000 Neo－Scope台式扫描电子显微镜用于大豆蛋白粉颗粒表面形貌表征，分别取3种粉体各少许铺于扫描电镜样品台上，喷金镀膜后观察不同粒径分布红花粉体的结构及表面形态。

1.4.2 化学分析

(1)高温大豆粕蛋白成分测定分别按照GB/T 5009.6——2003、GB/T 5009.3——2010、GB/T 5009.5——2010、GB/T 5009.4——2010的方法分别测定其蛋白质、脂肪、水分和灰分的含量。

(2)分离蛋白测定：按照GB/T 5009.6——2003测定最终提取液中的蛋白含量。按式(1)计算分离蛋白（SPI）提取率。

1.4.3 数据分析 数据计算与处理、相关分析用Origin 8.0与Microsoft Office Excel 2003软件进行；方差分析和多重比较采用SPSS 13.0软件进行。

2 结果与分析

2.1 大豆蛋白粉粒度分析

粒度或粒径表示颗粒的大小，通常是以单个颗粒为对象，而一堆粉体所涉及的并非单个颗粒，包含不同粒径的若干颗粒的集合体，即颗粒群。粒度分布就是以颗粒群为对象，表示该粒群中所有颗粒在一定粒度范围内的分布特征，它反映了各种颗粒大小及对应的数量关系[21]。粒度分布范围的不同造成颗粒群的物理化学性质也不同。用BT-9300H激光粒度分析仪测定3个样品的粒度分布，得出3个样品粉体粒度分布曲线见图1～3。

图1 样品1激光粒度分布Figure 1 Particle size distribution of Sample 1

图2 样品2激光粒度分布Figure 2 Particle size distribution of Sample 2

测定粉体的粒径，样品1的D90为274.54μm，D50为158.00μm；经过机械力化学处理的样品2的D90为26.79μm，D50为10.03μm；样品3的D90为10.45μm，D50为3.97μm。3种粉体的分布结果见图1～3。通过激光粒度分布仪分析可知，随着机械力化学作用方式的改变，大豆分离蛋白的中位径、体积平均径、面积平均径逐渐减小，比表面积逐渐增大。出现上述原因主要是因为气流破碎原理主要是依靠高速气流使料粉与料粉、料粉与内壁之间的产生强碰撞而达到破碎的效果；而震动粉碎的原理是物料由加料斗进入粉碎室，经振动将粉碎室内的研磨棒与物料碰撞、研磨而获得粉碎，该机配有水冷装置，可控制粉碎室内的温度。由于大豆蛋白属于有机态，富含脂肪，同样研磨时间，气流粉碎的效果相对振动粉碎效果偏弱一些。

图3 样品3激光粒度分布Figure 3 Particle size distribution of Sample 3

2.2 大豆蛋白粉的颗粒性貌分析

颗粒表面形貌对颗粒群的物理和化学性质产生诸多影响，如颗粒的比表面积、分散性、化学活性等[22]。取3种粉体少许，用适当溶媒分散，滴取样后自然干燥，黏台喷金，利用电子显微镜对4个样品进行表面形貌观察，用台式扫描电子显微镜对3种大豆蛋白粉颗粒表面形貌表征如图4～6。

图4 样品1扫描电镜照片（1 000倍）Figure 4 SEM micrographs of Sample 1

图5 样品2扫描电镜照片（1 000倍）Figure 5 SEM micrographs of Sample 2

图6 样品3扫描电镜照片（1 000倍）Figure 6 SEM micrographs of Sample 3

由图4可知，样品1粉体颗粒粒径普遍偏大，颗粒大小形状分布不均匀，表面无裂痕，结构紧密，有明显的断口块状结构；由图5可知，样品2与样品1相比，随着颗粒粒径减少结构更加紧密；由图6可知，样品3颗粒粒径偏小，颗粒表面较粗糙,且颗粒大小形状分布均匀，结构普遍松散，呈碎屑状，无明显的断口。随着颗粒粒径减小，比表面积增大，表面破损程度越严重，内部结构的有效成分越容易析出。与样品1相比，样品2和样品3经机械力化学处理后，粒径分布更加均匀，粉体粒径更小，比表面积也就越大。其特有的特征，如纤维性、晶型等均会失去。由图5可知，过180μm筛的大豆蛋白粉在放大1 000倍的电镜下仍可观察到较完整的植物组织结构，大部分细胞未被破碎。而经机械化学处理后，在放大1 000倍的电镜下已观察不到完整细胞，样品2的D90为26.79μm，样品3的D90为10.45μm，豆粕细胞可能已被充分破碎，细胞内的成分被暴露出来，呈释放状态。由此可知，颗粒粒径减小，比表面积增大，在机械力化学作用下造成细胞破碎而有利于大豆分离蛋白的溶出。

2.3 机械化学反应力对大豆蛋白分离的影响

机械力化学处理的机械力作用将会导致不同粒径颗粒化学成分的不同[23]。不同粒径当大豆蛋白粉的粗蛋白含量与蛋白质的溶解率详见表1。由表1可知，样品2和样品3大豆蛋白粉中的蛋白质浸出率分别比样品1提高47.6%、82%，与样品1大豆蛋白粉体中蛋白质的浸出率相比差异显著。大豆蛋白粉体粒度越小，蛋白质的溶解率越高。特别是当粒径D50为30μm时，其溶解率显著提高，而颗粒粒径D50为10μm时，蛋白质的溶解率最高为65.91%。由表1还可以得出，样品2及样品3豆粕组大豆分离蛋白的提取率两者差异极显著，样品2及样品3豆粕组分离蛋白中蛋白的含量无显著差异。可见，不同的粒径分布可显著提高大豆分离蛋白的提取率，但是对其粗蛋白含量提高无差异。

表1 机械化学处理对SPI提取率及蛋白含量的影响覮Table1 Effectof SPIand protein contentof Mechanical-chemical /%

4 结论与讨论

一方面由于机械力化学作用，经机械力化学处理后的豆粕，颗粒粒径减小，比表面积增大，豆粕细胞可能已被充分破碎，细胞内的成分被暴露出来，呈释放状态。由此可知，在机械力化学作用下造成细胞破碎而有利于大豆分离蛋白的溶出。另一方面样品2及样品3豆粕组大豆分离蛋白的提取率分别为53.46%和65.91%，两者差异极显著，样品2及样品3豆粕组分离蛋白中蛋白的含量分别为78.79%和79.78%。可见，不同的粒径分布可显著提高大豆分离蛋白的提取率，但是对其粗蛋白含量提高无差异。

目前，机械力化学处理可选择的设备普遍很多，常见的机械力化学处理设备有振动磨、气流粉碎系统、球磨机、搅拌磨、冲击式粉碎机等多种类型[24]。试验对QLM扁平式超音速气流粉碎系统与BFM-T6BI贝利振动粉碎机进行了比较分析试验，结果表明，以BFM-T6BI贝利振动粉碎机效果最好，相同粉碎时间，粉体粒径普遍较小，细胞破坏严重，可控制温度，有效成分的溶出率高。

1893年Lea最早进行机械力化学试验[4]。1951年Peters和Cremer对机械力化学进行系统的研究，Peters发表《机械力化学反应》的论文,指出能观察到研磨过程中各种固态反应，从而机械力化学引起了全世界广泛的关注[25]。机械化学反应作为一种机械处理的物理化学方法，是近年来的一个新技术。是化学领域的一个分支,也是粉碎技术不断深入发展的边缘学科。近年来,机械力化学技术被广泛应用于无机非金属材料和金属材料加工领域。机械力化学反应是固体物质在各种形式的机械能作用下所激发的化学变化和物理化学变化,以此来制备新材料或对材料进行改性处理。物料经机械化学应力的作用，可对某些天然生物资源的理化性能、功能特性和食用特性产生多方面的影响。食品经机械力化学处理，可使粉体粒径减小，具有极大的比表面积，粗糙程度增加，细胞破壁率提高，在生物、化学等反应过程中，反应接触的面积大大增加了，从而提高了有效成分的溶出率，且对有效成分改性，易于有效成分在人体吸收利用[26]。但机械力化学处理技术在食品加工领域中的应用也属于起步阶段，仍存在一些亟待解决的问题。食品经过机械化学反应力处理后的原料，可以提高发酵、酶解过程的化学反应速度，生产中节约了时间，提高了效率。因此，通过机械化学应力作用改变大豆分离蛋白的物理化学性质，在大豆分离蛋白降解中应用，具有一定的应用价值。

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