复合反胶束萃取花生蛋白的工艺优化
2013-05-02陈复生方志锋
郭 珍 陈复生 方志锋
GUO Zhen CHEN Fu-sheng FANG Zhi-feng
（河南工业大学，河南 郑州 450001）
(Henan University of Technology,Zhengzhou,Henan 450001,China)
花生中富含脂肪和蛋白质，既是主要的食用植物油来源，又可提供丰富的植物蛋白质。其中花生蛋白含量在22%～26%，花生中蛋白质的营养价值与动物蛋白质差异不大，比牛奶、猪肉、鸡蛋的蛋白质含量都高，而且胆固醇含量低，其营养价值在植物性蛋白中仅次于大豆蛋白[1]。由于花生中脂肪含量高达45%，在生产花生蛋白时必须先将油脂分离出去，而传统的制油方法均采用压榨或预榨—浸出的方法，过程中由于受到温度的作用均难保证蛋白质的质量，因此，寻求一种新型分离花生蛋白技术具有很重要的现实意义。
反胶束萃取技术是20世纪70年代提出的一种分离技术。反胶束是将表面活性剂溶于非极性溶剂中，通过偶极—偶极或离子对之间的相互作用形成的一种各向同性、光学上透明并且热力学上稳定的聚集体。在反胶束溶液中，表面活性剂非极性头朝外与溶剂接触，极性头朝内增溶一部分水形成“水池”，蛋白质等生物分子通过与“水池”之间相互作用实现萃取[2]。由于能形成反胶束的单一表面活性剂并不多或性质上有一定的局限性，且研究[3，4]发现，把不同类型表面活性剂混合起来制备可以形成具有良好性质的混合反胶束体系，增加增溶水量。因此，本试验试图选择AOT/SDS复合反胶束进行花生蛋白萃取，并通过正交优化选择最佳工艺。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料与试剂
全脂花生粉：河南帝鑫食品有限公司；
丁二酸二异辛酯磺酸钠(AOT)：上海海曲化工厂；
十二烷基硫酸钠(SDS)：天津市科密欧化学试剂有限公司；
卡尔费休液：天津市科密欧化学试剂开发中心；
异辛烷、正辛醇：分析纯，天津市博迪化工有限公司。
1.1.2 主要仪器设备
电子天平：BS210S型，德国Sartorius公司；
高速冷冻离心机：GL-20L型，上海安亭科学仪器有限公司；
自动水分滴定仪：ZSD-2J型，上海安亭电子仪器厂；
酸度计：pH 211型，意大利Hanna公司；
移液枪：Nichipet EXII型，日本Nichiryo公司；
紫外分光光度计：UV-1901型，北京普析通用仪器有限责任公司；
超声波清洗器：KQ-250B型，昆山市超声仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 蛋白质标准曲线制作 根据文献[5]。
1.2.2 原料蛋白含量测定 按GB/T 50095——2010第二法执行。
1.2.3 反胶束溶液中WO测定 根据文献[6]。
1.2.4 AOT/SDS复合反胶束配制 按一定的质量比称取AOT，SDS置于100mL锥形瓶，同时加入有机溶剂异辛烷，正辛醇，使其溶解，加入一定量一定浓度KCl的KH2PO4—Na2HPO4缓冲溶液，超声振荡至溶液透明。
1.2.5 花生蛋白的萃取 将配制的AOT/SDS反胶束溶液置于100mL锥形瓶中，加入一定量花生粉，超声处理一段时间，以5 000 r/min的转速离心5min，取上清液，用紫外分光光度计在280 nm处测定其吸光值(反胶束溶液作为空白液)。
1.2.6 花生蛋白提取条件的优化 以测定蛋白质前萃率为指标，分别考虑超声时间、花生浓度、超声功率、pH、离子浓度、温度、W0值、AOT(g)∶SDS(g)值以及表面活性剂浓度对萃取率的影响。基本条件：超声时间20 min，花生浓度0.01 g/mL，超声功率270W，pH值为7，离子浓度为0.01 mol/L，温度35 ℃，W0值 12，AOT（g）∶SDS（g）为 4∶3，表面活性剂浓度0.07 g/mL。本试验单因素设计中各因素变化值：超声时间3，6，9，12，20，25，30，35，40 min；花生浓度 0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06g/mL； 超 声 功 率 150，180，210，240，270，300 W；pH6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0；离子浓度 0，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mol/L；温度 25，30，35，40，45，50 ℃；W0值5，7，9，12，15；AOT(g)∶SDS(g)为 2∶3，3∶4，1∶1，4∶3，3∶2，2∶1；表面活性剂浓度 0.06，0.07，0.08，0.09，0.10，0.11 g/mL。在单因素试验结果的基础上，设计正交试验优化花生蛋白提取工艺。
1.2.7 蛋白质前萃率的计算 按式(1)进行。
式中：
R——花生蛋白前萃率，%；
m1——反胶束溶液中蛋白质的质量，g；
m2——原料中蛋白质的质量，g。
2 结果与分析
2.1 蛋白质定量分析标准曲线
蛋白质定量分析标准曲线见图1。
图1 蛋白质定量分析标准曲线Figure 1 Standard curve of protein quantitative analysis
2.2 单因素试验
2.2.1 超声时间对前萃率的影响 由图2可知，萃取率随时间的延长而增加，12min后基本达到最大，这是由于原料中蛋白不断向“水池”中迁移，使浓度差减小，萃取效率降低最终达到平衡，与单一表面活性剂形成的反胶束体系相比，萃取速度明显加快，这可能是由于降低了临界胶束浓度形成了更多的“水池”。
图2 超声时间对花生蛋白前萃率的影响Figure 2 Impacton peanut protein extraction rate by ultrasonic time
2.2.2 花生浓度对前萃率的影响 由图3可知，萃取率随花生浓度的增加而降低，主要原因是花生浓度的增加使空间位阻增加，而反胶束的聚集数以及增溶水量是固定不变的，花生蛋白之间的相互竞争致使萃取率降低。
图3 花生浓度对蛋白前萃率的影响Figure 3 Impact on peanut protein extraction rate by peanut concentration
2.2.3 超声功率对前萃率的影响 由图4可知，萃取率随超声功率的增加先增加后降低。超声波的空化作用以及机械效应为反胶束萃取提供了一定的推动力，降低分子扩散阻力，加快溶剂以及蛋白分子扩散速度，增加蛋白分子进入“水池”的可能性，从而使萃取率增加。此外，与单一使用SDS表面活性剂形成的反胶束体系相比节约能耗[7]。
图4 超声功率对花生蛋白前萃率的影响Figure 4 Impact on peanut protein extraction rate by ultrasonic power
2.2.4 pH值对前萃率的影响 由图5可知，萃取率随pH值升高呈先增大后减小。据报道[8]，蛋白质与反胶束之间的静电引力是萃取的主要推动力，而在试验中，pH等于8时萃取率最高，此时，蛋白分子带负电，与AOT、SDS带同种电荷，因此，有可能存在离子交互作用以及蛋白质疏水作用等影响着萃取过程。
图5 pH值对花生蛋白前萃率的影响Figure 5 Impact on peanut protein extraction rate by pH
2.2.5 离子浓度对前萃率的影响 由图6可知，萃取率随着离子浓度的增加先缓慢增加后快速下降。随着盐浓度增加时，表面活性剂周围的电层厚度变薄，减小了表面活性剂极性头之间的排斥作用，使反胶束变小，从而使蛋白质在反胶束中的增溶量减小，此外，盐浓度的增大同时对反胶束产生脱水效应，萃取率降低[9]。
图6 离子浓度对花生蛋白前萃率的影响Figure 6 Impact on peanut protein extraction rate by ionic concentration
2.2.6 温度对前萃率的影响 由图7可知，萃取率随温度的增加先升高后降低，在40℃时达到最大。温度升高一方面会增加分子热运动，使传质速率增加从而增加萃取率，另一方面，温度过高会破坏反胶束结构，同时使蛋白分子变性[10]。
图7 温度对花生蛋白前萃率的影响Figure 7 Impact on peanut protein extraction rate by temperature
2.2.7 W o对前萃率的影响 W o是反胶束的一个重要参数。反胶束物理性质主要取决于W o，W o决定了反胶束的大小和每个胶束中所含表面活性剂的个数。研究[11]发现，随着W o的增加，反胶束直径增加，且满足以下关系式dwp=0.29W o+1.1(2 图8 W o对花生蛋白前萃率的影响Figure 8 Impacton peanut protein extraction rate by W o 2.2.8 AOT(g)∶SDS(g)对前萃率的影响 由图9可知，萃取率随AOT(g)∶SDS(g)的升高呈先增大后减小。在比值为3∶2时达到最大，这有可能是因为混合表面活性剂改变了临界胶束浓度，AOT与SDS非极性端存在的排斥作用影响着反胶束的大小，形状以及增溶水的能力，有待进一步研究。 图9 AOT(g)/SDS(g)对花生蛋白前萃率的影响Figure 9 Impact on peanut protein extraction rate by AOT(g)/SDS(g) 2.2.9 表面活性剂浓度对前萃率的影响 由图10可知，随着表面活性剂浓度的升高萃取率逐渐降低。试验发现，在表面活性剂浓度小于0.06 g/mL时无法配成反胶束溶液。其原因可能是在浓度为0.06 g/mL时达到饱和状态萃取率最高，继续增加表面活性剂的量阻碍了蛋白质的萃取。 图10 表面活性剂浓度对花生蛋白前萃率的影响Figure 10 Impacton peanut protein extraction rate by Surfactant concentration 选取影响萃取的7个主要因素：温度、KCl浓度、pH、反胶束浓度、AOT/SDS、超声功率、WO，在花生浓度 0.01 g/mL，超声时间15min条件下，以萃取率为指标进行七因素三水平正交优化，确定萃取最佳工艺。因素水平表见表1，正交设计及结果见表2，方差分析见表3。由试验结果分析可知，各因素对试验结果影响的主次顺序为G>D>B>C>E>A>F，超声功率对试验结果影响最小，可以归为误差项。由表3可知，WO对花生蛋白前萃率影响极其显著，反胶束浓度以及KCL浓度对花生蛋白前萃率影响显著，温度、pH值、AOT与SDS比值对花生蛋白前萃率影响不显著。由表2可知，A1B1C2D3E1F1G3为最优方案，进行优化实验验证(n=7)，在此条件下，萃取率为93.33%。即最佳萃取条件为温度35℃，KCl浓度0 mol/L，pH 8，反胶束浓度 0.08 g/mL，AOT(g)∶SDS(g)为 4∶3，超声功率180W，WO值为 15。 表1 因素水平表Table1 Factors and levels 表2 正交试验设计及试验结果Table2 Orthogonal testand results 表3 方差分析Table3 Analysis of variance 表3 方差分析Table3 Analysis of variance F0.05(2，2)=19，F0.01(2，2)=99。 差异源 自由度F 显著性A B C D E G 1.570 21.551 7.624 45.366 7.200 577.658****误差项(F)离差平方和18.064 247.950 87.720 521.955 82.838 6 646.186 11.505 41 2 2 2 2 2 2 2均方v9.032 123.975 43.860 260.977 41.419 3 323.093 5.752 706 本试验采用AOT、SDS与异辛烷正辛醇形成的复合反胶束对花生中蛋白质进行萃取，研究发现，不仅萃取率得到提高，且萃取时间大大缩短，形成反胶束的效率也有很大提升，与单一反胶束体系相比表现出了明显的优势，通过单因素以及正交试验设计确定了最佳工艺条件：温度35℃，KCl浓度0mol/L，pH 8，反胶束浓度 0.08 g/mL，AOT(g)∶SDS(g)为 4∶3，超声功率180W，W o值为15。但AOT、SDS在溶剂中是通过怎样的连接方式形成反胶束，以及萃取过程中的相互作用力，萃取模型都尚未清楚，有待进一步研究。 1 周瑞宝,周兵,姜元荣.花生加工技术[M].北京：化学工业出版社，2012：188～195. 2 Luisi P L,Giomini M,Pileni M P,et al.Reverse micelles as hosts for proteins and smallmolecules[J].Biochimica et Biophysica Acta,1988(947):209～246. 3 Mitra R K,Paul B K.Investigation on percolation in conductance of mixed reversemicelles[J].Colloids and Surfaces,2005(252):243～259 4 Paul B K,Mitra R K.Water solubilization capacity ofmixed reverse micelles:effect of surfactant component,the nature of the oil and electrolyte concentration[J].Colloid and Interface Science,2005(288):261～279. 5 刘海远，布冠好，陈复生，等.超声波辅助CTAB反胶束萃取大豆蛋白的研究[J]农业机械，2011(7)：69. 6 陈复生，姚永志，磨礼现，等.利用反胶束萃取大豆蛋白同时酶水解的研究[J].中国粮油学报，2006，21(6):68～70. 7 高艳秀，陈复生，布冠好，等.超声波辅助SDS反胶束前萃花生蛋白研究[J].粮食与油脂,2012(7)：15～19. 8 赵晓燕.反胶束萃取大豆蛋白质结构与特性研究[D].北京:中国农业大学,2007. 9 高亚辉，陈复生，张书霞，等.反胶束萃取大豆蛋白前萃过程机理初探[J].食品与机械，2009，25(5)：70. 10 Noritomi H,Kojima N,Kato S,et al.How can temperature affect reversemicellar extraction using sucrose fatty acid ester[J].Colloid&Polymer Science,2006(284):683～687. 11 李润霞，陈复生，赵俊廷.反胶束萃取技术在食品中的应用研究[J].食品与机械，2006，22(5):115～119.
2.3 正交设计及试验结果
3 结论
