H2O2对Pb胁迫下小麦幼苗抗氧化酶及细胞活性的影响

叶亚新，陆丹华

摘要：以小麦（Triticum aestivum L.）为试验材料，采用完全营养液进行培养，外加适当浓度的过氧化氢（H2O2），同时以不加H2O2为对照，再以不同浓度Pb溶液培养进行Pb胁迫，检测小麦幼苗过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）的活性及丙二醛（MDA）含量、根系活力及微核率等指标的变化，以探究外源H2O2对Pb胁迫下小麦抗氧化酶及其细胞活性的影响。结果表明，Pb胁迫下小麦幼苗的生长代谢受到一定程度的抑制，主要表现为根系活力下降，POD、SOD、CAT活性增强，MDA含量和微核率上升；经适当浓度H2O2处理后，Pb胁迫小麦幼苗中POD、SOD、CAT活性及根系活力与对照相比有不同程度地上升，MDA含量及微核率下降，这表明外加H2O2对Pb胁迫小麦所受的伤害有一定的缓解作用，可增强小麦幼苗对重金属Pb的抗性。

关键词：小麦（Triticum aestivum L.）；H2O2；Pb胁迫；抗氧化酶；根系活力；微核率

中图分类号：Q945.78；S512.1 文献标识码： A 文章编号：0439-8114（2013）05-1007-05

Effect of Hydrogen Peroxide on Antioxidant Enzymes and Cell Activity of Wheat Seedlings under Lead Stress

YE Ya-xin，LU Dan-hua

（School of Chemistry and Bioengineering， Suzhou Science & Technology College， Suzhou 215009，Jiangsu， China）

Abstract： To explore the effect of exogenous H2O2 on antioxidant enzymes and other physiological indexes of wheat seedlings under lead stress， wheat seedlings cultivated in solution with different concentration of H2O2 were used to observe the variation of activity of peroxidase （POD）， superoxide dismutase （SOD）， catalase （CAT） and content of malondialdehyde （MDA）， root activity and micronucleus rate. The results showed that wheat seedlings were chronically harmed under heavy metal stress， as vigor of wheat seedling root decreased； POD， SOD， CAT activity and MDA content， micronucleus rate increased. After being treated by H2O2 with appropriate concentration， POD， SOD， CAT activity， root vigor increased while MDA content and micronucleus rate decreased in wheat seedlings under lead stress compared to control， indicating that exogenous H2O2 could reduce the damage caused by lead stress.

Key words： wheat（Triticum aestivum L.）； H2O2； lead stress； antioxidant enzymes； root activity； micronucleus rate

目前，在令人担忧的环境问题中，Cd、Pb等重金属污染因对植被造成强烈冲击以及沿食物链的富集作用而倍受关注。Pb作为一种有毒的重金属元素进入土壤后不能被微生物降解，一旦污染土壤，很难去除。有关植物受到重金属胁迫后自身抗氧化酶活性的变化已有一些研究，但主要集中在对Hg、Cd等重金属的研究上。关于植物受到Pb胁迫后对自身抗氧化酶活性及细胞活性的影响还少见报道。植物的生长发育受激素和环境信号的调控。过氧化氢（Hydrogen peroxide，H2O2）是一类重要的信号分子，在生物体内积累过多时会对生物体产生毒害作用[1]；但另一方面， 稀H2O2（<10 mg/L）能够提高水稻幼苗抗氧化酶活性，降低丙二醛（MDA）含量[2]；H2O2还与其他信号特别是植物激素相互作用，影响一些蛋白激酶与蛋白磷酸酶等一系列下游信号分子的产生和参与[3]。因此，H2O2可能在植物应对环境胁迫反应中发挥着重要的作用。

为探究H2O2对Pb胁迫下小麦（Triticum aestivum L.）幼苗抗氧化酶活性及细胞活性的影响，以小麦种子为培育对象，模拟Pb污染，外加H2O2培育后测定抗氧化酶活性及其他细胞活性指标，旨在考察利用H2O2作为植物抗重金属胁迫的拮抗剂的可能性，为H2O2在农业上的潜在应用提供生理生化依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试小麦品种为永良4号，由苏州市种子公司提供。

1.2 试验设计

1.2.1 小麦幼苗培育方法 小麦种子用水冲洗多次，挑除杂质，除去漂浮的种子，用10% H2O2浸泡 10 min，然后用去离子水冲洗4～5次，直至冲洗干净。淘洗后放入多于种子体积2～3倍的清水中，在室温下浸种8 h。

浸种后将挑选种子均匀放入底部铺有湿滤纸的培养皿中，在培养皿中放少量的去离子水（半浸没种子为宜），盖好培养皿，置于25 ℃的培养箱中催芽。水培催芽3 d左右，等根长至2 cm左右时撤掉下方的滤纸，以防小麦根长在滤纸上，然后去除小麦胚乳，分装到洗净晾干的培养皿中，继续置于25 ℃的培养箱中加完全培养液进行培养。待幼苗长出第二片真叶（二叶期，完全培养液培养4～5 d后）时进行H2O2对Pb胁迫下小麦幼苗影响的系列处理试验。

1.2.2 H2O2浓度的选择 为了确定H2O2对小麦幼苗生理功能的最佳效应浓度，设置了0.000 0（CK）、100.000 0、1.000 0、0.010 0、0.000 1 mmol/L 5种浓度的H2O2梯度溶液，加入小麦幼苗的完全培养液中，对照组加入等量蒸馏水，恒温培养5 d后测定小麦幼苗叶片的质膜透性，探究H2O2的剂量效应并进行H2O2最佳效应剂量筛选。

1.2.3 小麦幼苗处理方法 挑选相同长势的小麦幼苗分为两组，将试验组小麦的完全培养液中加入适量上述试验所选取最适浓度的H2O2进行预处理，CK组的完全培养液中加入等量去离子水，放入恒温培养箱中继续培养。培养72 h后将试验组和对照组均分为4小组，分别添加到0、10、50和100 mg/L的Pb（NO3）2溶液中，加入完全培养液后置于30 ℃、光照强度33%、光照14 h、黑暗10 h的光照培养箱中培育小麦，试验期间保证幼苗水培营养液充足，每天2次添加培养液，必要时更换完全培养液。5 d后分别测定两组小麦幼苗的过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）的活性及MDA含量、根系活性和根尖细胞微核率。

1.3 测定方法

POD、SOD、CAT活性及MDA含量、根系活力、叶片质膜透性（以相对电导度反映）的测定参照文献[4，5]；根尖细胞微核率的测定参照文献[6]。所有试验数据均采用统计软件SPSS 11.0进行相应分析处理。

2 结果与分析

2.1 H2O2溶液最适浓度的选择

梅俊学[7]、肖雯等[8]研究表明质膜的通透性可反映质膜系统的完整性及其伤害程度，质膜透性越大，植物受伤害程度也就越大。由图1可知，在不同浓度H2O2处理的小麦幼苗中，以0.010 0 mmol/L H2O2作用效果最好，不同浓度H2O2对小麦幼苗叶片质膜透性的效应由大到小依次为100.000 0、1.000 0、0.000 1、0.010 0 mmol/L。结果表明，高浓度的H2O2对小麦幼苗叶片有较严重的伤害作用，说明其在生物体内积累过多时，会对生物体产生毒害作用。而低浓度的H2O2处理时小麦幼苗叶片质膜透性较小，即低浓度的H2O2溶液在一定程度上能增加小麦膜结构的稳定性，增强小麦幼苗抵抗逆境的能力。因此，后续H2O2对Pb胁迫小麦幼苗的影响试验均采用最佳作用效应浓度0.010 0 mmol/L。

2.2 H2O2对Pb胁迫下小麦幼苗叶片POD活性的影响

POD对各种不良环境十分敏感，可作为判断伤害程度和植物抗性大小的指标[9]。试验结果（图2）显示，当小麦幼苗遭受到Pb2+胁迫时，POD活性发生相应变化。随着Pb（NO3）2胁迫浓度的升高，小麦幼苗POD活性逐渐升高，表明在一定浓度重金属胁迫下，植物体内 POD受到活性氧自由基的诱导，活性上升，参与清除自由基，在这一层面上讲POD活性的增加既表明了植物已经受到了重金属Pb的胁迫，同时也是一种保护机制。从图2可以看出，经过H2O2预处理后的小麦幼苗POD活性比对照有了一定程度的上升。说明H2O2能够在一定程度上增强小麦叶片的POD活性。

2.3 H2O2对Pb胁迫下小麦幼苗叶片SOD活性的影响

SOD作为氧自由基的清除剂，其活性高低与植物抗性密切相关[10，11]。黄玉山等[12]认为SOD活性提高是相应于活性氧增加的一种急性解毒措施，使细胞免受毒害的调节反应。由图3可见，经过H2O2预处理后的小麦幼苗叶片SOD活性与对照相比均有小幅上升，但在高浓度Pb（NO3）2溶液胁迫下，二者SOD活性均明显下降。说明各个剂量的Pb（NO3）2溶液对小麦幼苗已经造成伤害时，H2O2有利于小麦抵抗Pb胁迫所诱导的氧自由基对自身的伤害。但是当胁迫程度过于严重时，植物的自身调节系统被破坏，SOD活性下降。本试验结果与前人的研究结果一致[13]。这说明以SOD为代表的抗氧化酶系统对Pb毒害的保护作用是有限度的。当植物处于相对较低浓度的重金属胁迫时，植物体内产生较多氧自由基作为一种机体应激自卫反应，SOD活性上升可以提高植物清除氧自由基的能力，从而在一定程度上缓解氧自由基积累对细胞的破坏。但是，随着重金属胁迫浓度的增加至超过植物所能耐受的极限时，植物的自身调节系统被破坏，作为防御体系的酶的活性也相应减弱。这与低浓度重金属胁迫促进酶活性、高浓度重金属胁迫抑制酶活性的理论相符。

2.4 H2O2对铅胁迫下小麦幼苗叶片CAT活性的影响

当外界环境对植物产生胁迫时，CAT作为清除H2O2的主要酶类，其活性会产生变化[14]。试验结果（图4）显示，随着Pb（NO3）2浓度的升高，小麦幼苗叶片的CAT活性逐渐升高。经过H2O2预处理后的小麦幼苗叶片中CAT活性均明显升高，且在低浓度Pb（NO3）2溶液胁迫时CAT活性上升幅度较高。

2.5 H2O2对Pb胁迫下小麦幼苗叶片中MDA含量的影响

MDA作为膜脂过氧化指标，用于表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱[15]，其积累还可能对植物膜和细胞造成一定的伤害[16]。试验结果（图5）显示，在Pb（NO3）2溶液处理下，小麦幼苗MDA含量明显升高，且随着Pb（NO3）2浓度的增大，MDA含量升高，即高浓度的重金属对幼苗的胁迫作用更强。这表明植物处于逆境时，体内产生并积累的大量活性氧会引发膜脂过氧化，产生MDA等有害的膜脂过氧化产物。经过H2O2预处理的小麦叶片其MDA含量均比相应浓度对照组低，且低浓度Pb（NO3）2溶液处理的小麦MDA含量下降较明显，表明适当浓度的H2O2在一定程度上能降低植物体内MDA含量，减缓Pb2+对小麦幼苗的伤害；但当作用于小麦幼苗的Pb（NO3）2浓度较大时，H2O2表现出对重金属胁迫下小麦幼苗的防护效应减弱。

2.6 H2O2对Pb胁迫下小麦幼苗细胞活性的影响

2.6.1 H2O2对Pb胁迫下小麦幼苗根系活力的影响 根系活力是一种较客观地反映根系生命活动的生理指标[17]。植物遭受逆境胁迫时，植物体内琥珀酸脱氢酶减少，根系活力下降。由图6可以看出，小麦幼苗在Pb（NO3）2溶液胁迫下根系活力逐渐下降，其处理浓度越高，幼苗根系受到的伤害越大，根系活力越低。经H2O2溶液预处理后的小麦幼苗根系活力有一定提高，但是在高浓度Pb（NO3）2溶液胁迫下根系活力提高较少。这说明H2O2可以一定程度地缓解Pb胁迫对小麦幼苗根系造成的伤害。但H2O2对其的缓解能力在高浓度Pb环境下作用较小。

2.6.2 H2O2对Pb胁迫下小麦幼苗根尖细胞微核率的影响 细胞分裂中染色单体或染色体的无着丝粒断片或滞后染色体不包被于主核中，独立存在于细胞质中，类似细胞核，但体积较小，称为微核[18]。其形成机理一般认为是生物在环境中受到辐射或其他诱变因子作用时，细胞间期细胞受到损伤而产生微核。植物幼苗的根尖对环境污染物比较敏感，可以利用其微核效应监测环境污染物对植物的遗传毒理效应。由图7可以看出，小麦幼苗在Pb（NO3）2胁迫下，根尖细胞微核率逐渐上升。Pb（NO3）2的处理浓度越高，微核率越高，幼苗根系受到的伤害越大。经H2O2溶液预处理后的小麦幼苗根尖细胞微核率均有所下降，说明H2O2对Pb胁迫下小麦幼苗根系的遗传毒性有一定的防护作用。

3 讨论

逆境胁迫导致植物体内活性氧自由基的产生和清除失衡，造成植物体内自由基累积，导致膜脂过氧化，对植物的生长产生伤害。H2O2是一种重要的信号分子，能介导植物对非生物胁迫的适应反应。本研究表明，当用适当浓度的H2O2预处理小麦幼苗时，植物抗氧化酶POD、SOD、CAT活性增加，延缓膜脂过氧化作用的发生，从而降低了Pb胁迫小麦幼苗叶片中的MDA含量，提高了膜的稳定性，增强了小麦幼苗抵抗Pb胁迫的作用。

H2O2是活性氧重要的代表之一，激素等信号或者生物、非生物胁迫刺激均可诱导植物细胞内H2O2的产生和积累。H2O2化学性质比较稳定，寿命较长，具有较高的跨膜通透性并能在植物细胞间迅速扩散，外界刺激能迅速地刺激其合成和分解，这些特点均符合细胞间信号分子所具有的重要标准。越来越多的证据表明，H2O2在植物面临环境胁迫反应中发挥着重要作用，比如应对逆境产生抗病防御反应、调控植物的生长发育、参与保卫细胞气孔运动等诸多生理过程。H2O2还与其他信号分子特别是植物激素相互作用影响一些蛋白激酶与蛋白磷酸酶等一系列下游信号分子的产生和参与。越来越多的试验证据表明，高浓度的H2O2溶液能损伤生物大分子，产生细胞毒害作用[19]，但低浓度的H2O2溶液作为信号分子可以扩散到细胞的各个部位，参与多种生理作用，甚至对植物的生长起到促进作用。

Pb胁迫能够影响植物体内活性氧代谢系统的平衡，Pb胁迫下，小麦幼苗的根系活力下降，而MDA含量、POD、SOD和CAT活性和微核率均有所上升，这表明重金属Pb对植物幼苗存在明显毒害作用，能够胁迫其生长和代谢。而植物可通过细胞保护酶系统自我调节来抵制逆境胁迫对机体的伤害，作为植物的保护酶系统，POD、SOD、CAT相互协调，SOD催化O2-·生成H2O2和O2；CAT则具有分解H2O2的作用，与SOD协同作用，可以最大限度地减少·OH的形成；POD则能清除细胞内的过氧化物[20]，可以在一定程度上减轻活性氧对植物细胞的伤害。而MDA含量和微核率上升、根系活力下降可表明小麦幼苗受Pb2+胁迫伤害的程度。经0.010 0 mmol/L H2O2预处理后的小麦幼苗POD、SOD、CAT活性均有不同程度地上升，而MDA含量下降，说明外加H2O2溶液降低了小麦幼苗叶片的膜脂过氧化程度，减缓了Pb2+对小麦幼苗的伤害。这表明适量的H2O2能够增强小麦幼苗抗氧化酶的活性，能够更快速地清除活性氧自由基，减少积累，降低膜脂过氧化程度，增强小麦幼苗对抗Pb2+胁迫伤害的防护作用，H2O2对Pb2+胁迫下小麦幼苗的防护作用在一定程度上体现在MDA含量的减少。而根系活力的上升及微核率的下降也能说明H2O2除了能增强抗氧化酶活性外，还能通过其他机制增强细胞活性。

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