瑞香狼毒总黄酮超临界CO2萃取工艺的优化

罗喜荣等

摘要：探讨超临界CO2萃取瑞香狼毒（Stellera chamaejasme L.）中总黄酮的优化工艺条件，采用响应曲面法考察萃取压力、萃取温度、乙醇用量对总黄酮收率的影响。结果表明，优化的萃取条件为萃取压力27 MPa、萃取温度52 ℃、乙醇用量3 mL/g，此条件下总黄酮收率为1.412%。

关键词：瑞香狼毒（Stellera chamaejasme L.）；总黄酮；超临界CO2萃取；响应曲面法

中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）06-1404-02

瑞香狼毒（Stellera chamaejasme L.）是瑞香科狼毒属植物，其药用部位为根，在中国西北、西南、东北等地区广为分布，资源极其丰富。现代药理研究及临床应用表明，瑞香狼毒具有抑制肿瘤细胞增殖、阻止细胞分裂、诱导细胞凋亡等作用，其抗肿瘤作用效果显著[1]。瑞香狼毒具有结构较特殊的双二氢黄酮类、香豆素类、木脂素类等化合物，有利于抗肿瘤活性物质的筛选，是理想的天然药物开发品种。有研究表明瑞香狼毒的总黄酮提取物急性毒性较小，对体外培养的肿瘤细胞有较强的抑制作用，其作用强于长春新碱，对小鼠移植性肿瘤抑制率与环磷酰胺接近，能明显抑制肝癌细胞的增殖，其作用呈现明显的剂量-时间依赖性，具有很大的潜在药用价值[2，3]。

目前瑞香狼毒总黄酮的提取方法主要有回流提取法、索氏提取法、超声波辅助提取法等[4，5]，这些方法耗时较长、溶剂用量大。超临界CO2萃取技术具有步骤简单、选择分离效果好、提取率高、不破坏活性物质的结构和性质等优点，本研究采用Box-Behnken响应曲面法对超临界CO2萃取瑞香狼毒中总黄酮工艺进行优化，寻找最佳工艺条件，为瑞香狼毒总黄酮的开发利用打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

原料：瑞香狼毒由甘肃省兰州市生产，将其粉碎成1 mm颗粒备用。试剂：芦丁标准品购自中国药品生物制品检定所，所用化学试剂均为分析纯。仪器：4 L超临界萃取装置为自行研制，F-2500型荧光分光光度计购自日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 总黄酮的提取 采用Box-Behnken响应曲面设计法，以萃取压力、萃取温度、乙醇用量为自变量，以总黄酮收率（y）为响应指标设计三因素三水平试验方案，试验因素与水平见表1。取瑞香狼毒粉200 g置于超临界萃取器，设定萃取时间为1 h、CO2流量为20 L/h、解析压力为5 MPa、解析温度为60 ℃。当达到预定温压条件，启动夹带剂泵，定量打入95%乙醇，萃取过程中从解析器收集萃取液。

1.2.2 总黄酮收率的测定 精密称取10 mg芦丁，用甲醇溶解、定容至10 mL，配制成1 mg/mL的标准储备液；分别取芦丁标准储备液5、10、15、20、25 μL置于5 mL比色管中，加入0.6 mL 0.1 g/L AlCl3-甲醇溶液，用甲醇定容至刻度，配制成系列标准工作溶液。在激发及发射通带均为10 nm、激发波长为435 nm、发射波长为490 nm条件下测定芦丁标准工作溶液的荧光强度，以荧光强度相对应的浓度绘制工作曲线，得线性回归方程为■=39.74x+10.41，其中，y为荧光强度，x为芦丁浓度（μg/mL），相关系数r=0.998 4。取一定体积的样品液挥干用同法测定，根据工作曲线计算总黄酮浓度及收率（y）。y=总黄酮质量（g）/原料质量（g）×100%。

2 结果与分析

2.1 试验结果与模型方程的建立

总黄酮的超临界CO2提取响应曲面试验设计方案与结果见表2。利用Minitab 16软件对表2试验数据进行多元回归拟合，得响应曲面二次多元回归模型：■=-3.137 46+0.069 73x1+0.105 27x2+0.393 60x3-0.001 40x12-0.001 06x22-0.047 29x32+0.000 13x1x2+0.000 09x1x3+0.001 02x2x3，对该模型进行方差分析，结果见表3，回归模型系数显著性检验结果见表4。由表3可知，模型P=0.001<0.01，表明该模型极显著，失拟项P=0.062>0.05不显著，R2=0.983 2说明该模型拟合程度较好，试验误差小，可以用此模型对总黄酮的超临界CO2提取进行分析和预测。由表4可知模型中一次项x1、x2及二次项x12显著，二次项x22极显著，其他项均不显著。

2.2 响应曲面分析与优化

根据回归模型作出响应曲面图，见图1至图3。运用软件响应优化器望大寻优得到总黄酮最佳提取工艺条件为萃取压力27.58 MPa、萃取温度52.73 ℃、乙醇用量3 mL/g。为检验响应曲面法所得结果的可靠性，采用上述优化提取条件进行总黄酮的超临界CO2提取，为方便实际操作将提取工艺参数修正为萃取压力27 MPa、萃取温度52 ℃、乙醇用量3 mL/g，此条件下总黄酮理论收率为1.437%，经验证试验得到总黄酮收率为1.412%，与理论预测值非常接近，表明基于响应曲面法获得的优化提取工艺参数准确可靠，具有实用价值。

3 结论

通过响应曲面法建立了瑞香狼毒总黄酮收率与萃取压力、萃取温度、乙醇用量关系的回归模型，经检验证明该模型准确有效，超临界CO2萃取瑞香狼毒总黄酮优化工艺条件为萃取压力27 MPa、萃取温度52 ℃、乙醇用量3 mL/g，此条件下总黄酮收率为1.412%。

近年来研究发现，瑞香狼毒具有抗惊厥、抗癫痫、抗肿瘤、抗菌、抗结核、抗病毒、抗氧化、改善机体免疫功能等多种药理作用，不良反应相对较小、较少，是一种有价值的宜于深入研究的中药。

参考文献：

[1] 梁秀艳，吴琳华. 中药瑞香狼毒抗肿瘤作用研究概况[J]. 中国中医药科技，2008，15（1）：80-81.

[2] 王 敏，贾正平，马 骏，等. 瑞香狼毒总黄酮提取物的抗肿瘤作用[J].中国中药杂志，2005，30（8）：603-606.

[3] 吴晓亮，韩 敏，刘晓松，等. 不同瑞香狼毒提取物对肝癌细胞的抑制作用[J]. 畜牧与饲料科学，2009，30（9）：5-6.

[4] 吴晓亮，韩 敏，刘晓松，等. 瑞香狼毒总黄酮3种提取方法的比较[J]. 畜牧与饲料科学，2009，30（1）：39-40.

[5] 张如刚，刘晓松，哈斯苏荣，等. 不同提取方法对瑞香狼毒总黄酮含量的影响[J]. 黑龙江畜牧兽医（科技版），2010（1）：129-131.