年龄相关性白内障晶状体囊膜中P33ING1的表达

乔淑琴等

摘 要 目的：探讨年龄相关性白内障的发生与晶状体前囊膜中P33ING1表达之间的相关性。方法：收集30例年龄相关性白内障及10例透明晶状体前囊膜，采用免疫组织化学法，分别观察透明晶体组和白内障组晶状体上皮细胞中P33ING1阳性表达水平。结果：白内障患者晶状体囊膜中P33ING1含量较正常人明显增高。结论：P33ING1在年龄相关性白内障的形成过程中起重要作用。

关键词 年龄相关性白内障 晶状体上皮细胞 P33ING1

白内障是世界范围内的首位致盲性眼病。目前，对于它的病因和发病机制并未完全明了。1995年Li等提出[1]，晶状体上皮细胞的凋亡是各种非先天性白内障共同的细胞学基础。P33ING1是近年来新发现的一种生长抑制基因，具有促进细胞凋亡，抑制细胞生长的作用。目前临床上关于P33ING1的研究主要集中在各类恶性肿瘤的诊断和治疗方面，针对年龄相关性白内障，P33ING1基因在国内外文献中鲜见报导。本研究应用免疫组织化学方法检测P33ING1基因在年龄相关性白内障晶状体上皮细胞中的表达情况，从蛋白水平初步探讨P33ING1基因在年龄相关性白内障发生发展过程中的作用，从而对年龄相关性白内障的临床治疗及新药开发提供可能的手段和新的思路。

资料与方法

2007年9月～2008年1月收治老年性皮质性白内障患者30例（30只眼），男14例，女16例，年龄60～80岁，平均67.24±5.47岁。入选病例除外高度近视、葡萄膜炎、糖尿病、自身免疫病、神经变性疾病、恶性肿瘤患者等影响晶状体囊膜代谢的局部或全身性疾病。术前常规行裂隙灯显微镜、角膜曲率、眼科A、B超检查，术中采用连续环形撕囊，取其中央部晶状体前囊膜作为白内障组。在兰州大学第二附属医院眼库中另取10例（10只眼）非正常死亡的透明晶状体前囊膜作为对照组。两组晶状体前囊膜用4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，每例标本做4μm厚连续切片，用于免疫组织化学染色，并做HE染色确定诊断。

主要试剂：鼠抗人P33ING1单克隆抗体（工作浓度25μg/ml），鼠抗人P53单克隆抗体（工作浓度1：200）、S-P试剂盒及DAB染色剂等。

免疫組织化学染色法检测蛋白水平的表达：采用免疫组化S-P法，具体操作按说明书进行。每次染色均同步设阴性和阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照，检测P33ING1用鼠脑做阳性对照，检测P53时所用阳性对照为公司提供。

结果判定：P33ING1蛋白表达阳性细胞均为细胞核呈棕黄色。表达结果以高倍镜（×400）下每张切片随即选择5个高倍视野，用Image-ProPlus 5.0软件进行灰度值扫描。

统计学处理：所有结果应用SPSS11.5软件包进行统计学处理。对结果采用t检验分析。

结 果

免疫组织化学染色结果显示，在正常透明晶状体前囊膜中，P33ING1蛋白极低表达，而在年龄相关性白内障晶状体前囊膜中，可见P33ING1蛋白高表达。正常组与白内障组P33ING1蛋白表达阳性细胞差异有显著性。

讨 论

细胞凋亡是有核细胞在凋亡信号刺激作用下通过启 动细胞内死亡机制，经过一系列信号传导途径，最终发生细胞程序性死亡的过程。1995年Li等首先用Tunel法及DNA电泳法对20例不同类型白内障患者的晶状体上皮细胞进行检测，并在电镜和光镜下发现了凋亡的晶状体上皮细胞，相反在8名正常人晶状体上皮细胞中几乎无凋亡细胞。同时在H2O2、紫外线、钙离子载体诱导的白内障晶状体离体实验中[2]，也发现了晶状体上皮细胞中有大量凋亡细胞存在，因此推测晶状体上皮细胞的凋亡可能是各种非先天性白内障发生的共同细胞学基础。ING1基因是1996年Garkavtsev等分离出的一种新基因。它在正常情况下对细胞生长有抑制作用[3]，故命名为生长抑制因子1。ING1mRNA有ING1a，ING1b，ING1c三种变位剪接形式，分别编码三种不同的蛋白质P47ING1a，P33ING1b，P24ING1c，其中P33ING1b目前研究较多，它在几乎所有的正常组织细胞中核表达，而其胞质表达比较受限[4]。Helbing等证实P33ING1b的过表达可促进由“血清饥饿”诱导的细胞凋亡[5]，此外Helbing等还证实P33ING1b可显著影响c-myc诱导的凋亡效果，并且可能参与以诱导c-myc过表达激活凋亡的效应途径。Scott等指出[6]，紫外线可引起P33ING1b与增殖细胞核抗原（PCNA）结合。这一复合物有利于在DNA复制期对DNA损伤细胞进行修复，如果不能完成对细胞DNA的修复，则可促使损伤细胞发生凋亡。

本研究应用免疫组织化学法观察正常透明晶状体上皮细胞与年龄相关性白内障晶状体上皮细胞，证实在正常人的透明晶状体中P33ING1的表达极低，而在年龄相关性白内障中P33ING1的阳性表达明显高于正常组，提示在年龄相关性白内障的发生发展过程中，由于各种危险因素（主要为紫外线辐射作用）的存在，可引起晶状体上皮细胞的氧化损伤，生成大量的自由基，通过多种途径作用于DNA，导致DNA损伤，引起P33ING1介导的DNA损伤修复，如不能完成对DNA的修复，则晶状体上皮细胞出现凋亡，最终导致晶状体混浊。

展望未来，针对老年性白内障目前最有效的治疗方法为手术治疗，但术后部分患者可发生后发性白内障，其发生原因主要为白内障术后残留的晶状体上皮细胞的增殖、迁移和纤维化生。虽然YAG激光后囊切开可治疗后囊的混浊，但他仅保持中央部的透明，后囊周边部的混浊可阻碍眼底检查，进一步限制了对视网膜周边部某些病变的有效治疗。因此，研究年龄相关性白内障晶状体上皮细胞中P33ING1的表达情况，可促使人们从基因水平认识其在年龄相关性白内障DNA损伤修复中的作用。为寻找更为有效的白内障治疗方法提供新的理论依据。而进一步研究P33ING1在后发性白内障的发生机制中是否有相关性，也为白内障手术后降低后发性白内障的发生开辟了一条新的途径。

參考文献

1 Li WC，SPector A.Lens ePithelial cell aPoPtosis is an early event in the develoPment of UBV-induced cataract.Free Radic Biol Med，1996，20：301.

2 LiWC，Kuszak JR，Wang GM，Wu ZQ，SPector A.Calcimycin-induced lens ePithelial cell aPoPtosis contributes to cataract formation[J].ExP Eye Tes，1995，61：9.

3 Garkavtsev I，Kazarov A，Riabowol K，et al.SuPPression of the novel growth inhibitor P33ING1 Promotes neoPlastic transformation[J].Nat Genet，1996，14（5）：415-420.

4 Jager D，Stockert E，Chen YT，et al.Cancer2testis antigens and ING1 tumor suPPressor gene Product are breast cancer antigens：Characteriza tion of tissue2sPecific ING1 transcriPts and a homologue gene[J].Can2cer Res，1999，59（20）：6197-6204.

5 Helbing CC，Veillette C，Riabowol K，et al.A novel candidate tumor suPPressor，ING1，is involved in the regulation of aPoPtosis[J].Cancer Res，1997，57（7）：1255-1258.

6 Scott M，Bonnefin P，Vieyra D，et al.UV2induced binding of ING1 to PCNA regulates the induction of aPoPtosis[J].J Cell Sci，2001，114（19）：3455-3462.