骨移植材料成骨效能检测指标及方法的选择与应用

李泽键　赖仁发

目前，临床上对于骨移植材料的需求量日益增加，各种类型的骨移植材料已经在实验研究中取得了一定的成效并逐渐进入临床应用研究阶段，评价骨移植材料成骨效能的指标也愈来愈多样化，各项指标之间各有侧重，从不同的角度反映材料的骨修复能力。本文通过检索近几年的相关研究文章，对各项评价骨材料成骨效能的检测指标及其对应的检测方法做了如下总结。本文将成骨效能的检测指标归纳为新骨形成，微血管形成，成骨活性标志物的表达，骨组织形态及生物强度检测等几个方面，根据检测指标的需要，对各种特异性检测方法也作了总结，现综述如下。

1 新骨形成与骨组织形态的检测

1.1 影像学检测：X-ray是最常见，也是最原始的检测方法，早在1896年便开始应用于医学影像，是目前医学诊断的重要手段之一。目前，研究者在使用X-ray的同时，多采用一些定量或半定量的评分标准，对X-ray显像结果进行定量分析、比较。窦洪磊等[1]应用X-ray结合Lane-Sandhu评分系统对同种异体骨移植修复大段骨缺损疗效进行检测，将X-ray显像结果通过计分转变为数值进行统计分析与比较。Mahesh等[2]采用X-ray结合Kuznetsov半定量评分标准检测人类骨髓间充质干细胞的体内成骨情况，同样将X-ray检测结果转化为计分，利用统计学方法进行分析比较。

螺旋CT三维重建在骨缺损修复疗效的检测方面目前应用较多，利用多层螺旋CT进行图像分析和骨密度测定可以更直观地了解骨组织缺损重建后局部组织再矿化的程度。国内外学者已应用定量CT进行三位的骨密度测量，并取得了一定成果[3-4]。多层螺旋CT 技术能将骨皮质和骨松质的图像显示得更加清晰，通过调整图像能使人眼更易观察到细微的灰度变化，以便更加精确和全面地对冠状位、矢状位和横断面的三维CT图像进行测量，准确反映局部骨密度变化；螺旋CT图像不仅可以通过不同灰阶度显示其密度的高低，还可用组织对X射线的吸收系数反映其密度高低的程度，即CT 值。Maki等[5]通过体外试验显示，CT值与羟基磷灰石浓度有较高的相关性。Norton等[6]及Shahlaie等[7]亦认为CT值用于对缺损区修复再造后骨密度的评价具有一定的价值，可以用CT测量值来预测骨密度。

CBCT是近几年新发展的检测技术，它具有一次扫描、三维成像，三维影像更加清晰，最小分辨率可达到0.125mm，并可以实时显示横纵断面的三维影像，使得成骨效能的检测更加全面、直观、可靠。随着CBCT在口腔医学影像诊断学的发展应用，已有不少研究者将CBCT应用于颌面骨缺损修复效果的检测。刘苗等[8]应用CBCT观察人工骨对兔下颌骨缺损的修复效果，得到清晰的三维图像，能够多角度多层面地观察下颌骨缺损修复后的成骨情况，提示CBCT作为骨效能检测手段的可行性。Roe等[9]及Kim等[10]也应用CBCT评价骨缺损修复的效果，认为CBCT在骨检测方面具有广阔的应用前景。

1.2 组织形态学检测：伊红-苏木素染色法 （hematoxylin-eosin staining），简称HE染色法，石蜡切片技术里常用的染色法之一，科研中最基本、使用最广泛的技术方法。其原理是去氧核糖核酸（DNA）带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色。伊红Y是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷的阳离子结合使胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明对比。目前，HE染色不仅应用于骨组织标本的定性分析，也结合一些评分标准进行定量分析，如有学者采用HE染色结合Nibson骨缺损组织形态学评分标准对骨组织形态进行定量分析取得了不错的效果[11-12]。

茜素红染色（alizarin red S staining）同样也是一种钙结节的特异性染色方法，其原理是茜素红能够与钙离子发生显色反应，产生一种深红色的鳌和物，用以识别组织细胞的钙盐成分，将沉积的钙盐结节染成深红色，主要适用于动物原生代或培养细胞的钙沉积和钙化结节检测。但它的缺点是容易受到其它金属元素的干扰。目前，大量的国内外学者对于培养细胞表明钙盐的沉积及新骨组织中钙结节的检测均倾向于采用茜素红染色，充分体现其检测的特异性及可靠性[13-16]。

1.3骨密度及骨矿化检测：骨密度（bone mineral density， BMD），全称“骨骼矿物质密度”。影像学领域的骨密度是指单位骨体积或面积的平均骨矿物质含量， 是反映骨质量的重要指标。早期、精确地BMD检测可以及时了解骨质的变化。目前主要是使用骨密度仪对BMD进行检测，通过测定人体骨矿并获得各项相关数据，结果数据以T值为主，还包括Z值、骨密度、骨量等数据，目前市场上主流的骨密度仪分为双能X射线骨密度仪和超声骨密度仪两大类，其中以双能X线方式测试的结果较准确，是国际卫生组织（WHO）采用的骨密度金标准。双能X射线骨密度仪可测量全身任何部位的骨量，精确度高，对人体危害较小，测得的数据准确，已被国内外学者广泛应用于骨移植材料成骨效能的检测。Gautam等[17]采用骨密度仪检测复合骨移植材料的峰值骨量，测得新骨组织的矿化程度及新骨形成率、矿化率等指标，从而精确、定量地反映了移植材料的成骨效能。Chen等[18]采用双能X射线骨密度仪检测一种中药提取物复合材料移植大鼠牙槽骨后的BMD，从而反映了实验组相对于对照组明显的成骨作用。此外，Xie等[19]采用了另外一种检测方法—Micro-CT检测骨组织的BMD，同样证实了骨移植材料量化的成骨效能。

2 成骨活性标志物的表达检测

2.1 碱性磷酸酶：碱性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP） 是广泛分布于人体骨骼组织的一种酶，它不是单一的酶，而是一组同功酶，目前已发现有ALP1、ALP2、ALP3、ALP4、ALP5与ALP6六种同功酶。ALP确切的生理作用目前仍不十分清楚，但它在骨组织中相当活跃，一般认为骨中ALP和骨的钙化作用密切相关，成骨细胞中的ALP作用产生磷酸，与钙生成磷酸钙沉积于骨中。因此，检测ALP的活性程度，可以反映成骨过程中的钙盐沉积情况。李晓峰等[13]利用碱性磷酸酶试剂盒检测移植骨的ALP活性，结果发现阳性细胞可见蓝黑色颗粒沉积在胞浆碱性磷酸酶活性部位。Chen等[18]，Li等[20]及Kim等[21]通过免疫印迹等方法检测ALP的活性来评价骨移植材料的成骨效能。

2.2 骨钙素/骨钙蛋白：骨钙素（bone gamma- carboxyglutamic-acid-containing proteins，BGP）又称骨钙蛋白（osteocalcin），该蛋白在骨矿化峰期之后才出现积聚，由成骨细胞合成并分泌，不受骨吸收因素的影响。通过检测血清骨钙素水平可以了解成骨细胞，特别是新形成的成骨细胞的活动状态。骨钙素值随骨更新率的变化而不同，骨更新率越快，骨钙素值越高，反之降低。Chen等[18]通过ELISA法检测骨钙蛋白的含量，从而评价骨移植材料在骨修复过程中的成骨效应。贾春蓉等[22]采用125I 放免法检测细胞上清液中骨钙素含量，从而评价研究对象的成骨活性。

3 骨组织生物学强度检测

修复骨缺损不仅要恢复骨形态的连续，重要的是重建骨的支撑功能，这就要求骨移植材料的生物力学性能应尽可能达到正常骨皮质的力学性能。李明等[11]于移植后16周对移植骨块进行生物力学三点抗弯曲实验载荷、弯曲应力检测， 实验组与实验对照组新骨生成有显著性差异，而与正常骨组织之间无显著性差异。简月奎等[23]对植入后24周的移植骨块进行生物力学检测，结果显示移植骨块的抗压缩压强及极限压强、抗弯曲载荷及极限载荷、抗扭转转矩及极限转矩与自体骨组及正常骨组均基本相似。

4 小结与展望

随着对各种组织工程骨移植材料的深入研究，对于各种检测指标及方法的应用也逐渐成熟。但是，目前现有的检测指标及检测方法尚未形成一定的体系与标准，一些检测指标的金标准尚未确定。另外，对骨材料移植后成骨效能的检测仍较大程度地停留在离体组织的静态检测，对于活体成骨效能的动态检测指标及方法仍有待进一步研发。

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[收稿日期]2012-12-01 [修回日期]2013-03-26

编辑/李阳利