NaCl胁迫对华山松种子发芽和幼苗生长的影响

2013-04-29王瑞苓汪元超刘建祥汪梦婷

湖北农业科学 2013年8期

王瑞苓汪元超刘建祥汪梦婷

摘要：以华山松为研究对象，探讨了NaCl胁迫对华山松种子发芽和幼苗生长的影响。结果表明，在100 mmol/L及以下NaCl溶液浓度处理下，华山松种子均能正常发芽，幼苗也生长正常。在NaCl胁迫试验浓度范围内，华山松种子的发芽率、发芽势、简易活力指数、幼苗鲜重均呈现出先升高后降低的变化趋势，而幼苗干重呈现持续下降的变化趋势；幼苗体内的可溶性糖、叶绿素、丙二醛含量及SOD活性也是随着NaCl溶液浓度的提高呈现出先升高后降低的变化趋势，在50或100 mmol/L NaCl溶液浓度处理下达到最大，分别比无NaCl胁迫处理的提高了114.68%、12.46%、21.76%、293.51%。说明华山松耐NaCl胁迫的潜力相当可观，作为耐盐碱植物培养前景广阔。

关键词：华山松；NaCl；胁迫；种子；幼苗

中图分类号：S791.241；Q948.113；S723.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）08-1859-05

土壤盐碱化是指土壤中可溶性盐类随水分向表层移动并积累下来，而使可溶性盐含量超过0.3%的自然地质过程[1]。土壤中的盐分主要是风化产物和含盐的地下水带来的，灌溉水含盐和施用生理碱性肥料也会使土壤中的盐分增加。土壤盐碱化后，土壤溶液的渗透压增大，土体通气性、透水性变差，养分有效性降低，使作（植）物不能正常生长。中国的土壤盐碱化非常严重，现有盐碱地0.99×108 hm2[2]。随着环境的逐渐恶化，土壤盐碱化的范围不断扩大，盐碱程度越来越严重，每年因盐碱化废弃的土地约为25万hm2，这给农林业生产带来了巨大的经济损失[3]。华山松（Pinus armandii Franch.）是中国特有的针叶树种，能适应多种土壤，广泛分布于海拔1 000～3 500 m的地区[4]；由于其材质好，果用经济价值很高，且为长江防护林的主要造林树种，现在已经被多个省（市）鼓励推广种植；然而目前尚未见到有关华山松在盐胁迫下的生理生化变化的文献报道。因此，试验开展了华山松在NaCl胁迫条件下的生理变化研究，以期为其在土壤盐碱化土地上的生长提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料及处理

华山松种子购于云南省林木种苗站。挑选子粒饱满、整齐一致的种子，清水洗净，5% KMnO4溶液消毒30 min，去离子水清洗3次，再清水浸种4 h，备用。将种子放入铺有双层滤纸的已灭菌的培养皿中，分别用25、50、100、200、300 mmol/L 的NaCl（化学纯）溶液处理种子，以去离子水为对照，3次重复，每重复100粒种子，然后在上面再覆盖2层滤纸。将NaCl溶液处理过的华山松种子放入恒温培养箱中28 ℃培养发芽，每天光照8 h，光照度1 250 lx，并每天通风片刻，在发芽过程中及时补充水分[5]。

1.2 测定项目与方法

1.2.1 种子发芽指标从试验的第一天开始每天观察、记载发芽数，以华山松种子长出的胚根长度达到种子长度的1/2为种子发芽标志，每天定时统计各培养皿发芽的种子数目。根据国家林木种子检验规程[6]，在经过21 d发芽后结束发芽试验，试验测定的种子发芽指标有发芽率、发芽势、简易活力指数（Simplied vigor index，SV）[6-8]。

发芽率（G）=最终发芽的种子数/供试种子数×100%；

发芽势（Gv）=前3 d发芽的种子数/供试种子数×100%；

简易活力指数（SV）=平均苗长或鲜重×G，试验选择鲜重；

幼苗的鲜重为每个处理随机取10株发育正常的幼苗，洗净、晾干后在天平上称取质量，取单株均值；

幼苗的干重为每个处理随机取10株发育正常的幼苗，洗净、晾干后在烘箱里先105 ℃烘30 min、再80 ℃烘至恒重，冷却后用天平称出质量，取单株均值。

1.2.2 幼苗生理生化指标试验测定的幼苗生理生化指标有可溶性糖（Soluble sugar）含量、叶绿素（Chlorophyll）含量以及超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量。其中可溶性糖含量采用蒽酮法测定[9]，叶绿素含量采用分光光度法测定[9]；SOD活性采用氮蓝四唑（Nitro-blue tetrazolium，NBT）法测定[9]；丙二醛含量采用硫代巴比妥酸（Thiobarbituric acid，TBA）法测定[10]。

1.3 数据处理

所有数据均采用Microsft Office Excel 2003及SAS 9.0软件进行统计分析，并采用邓肯氏新复极差法（Duncan′s new multiple-range test）分析比较[11]。

2 结果与分析

2.1 NaCl胁迫对华山松种子发芽和幼苗生长的影响

2.1.1 NaCl胁迫对华山松种子发芽的影响发芽率、发芽势和简易活力指数是评价种子发芽的常用指标，NaCl胁迫对华山松种子发芽的影响结果见表1，由表1可知，NaCl溶液浓度在0～100 mmol/L内时，华山松种子的发芽率均在70%以上，发芽势在40%以上，简易活力指数在4.50以上；说明0～100 mmol/L的NaCl溶液浓度对华山松种子发芽指标的影响不大。进一步分析发现，发芽率、发芽势与简易活力指数在NaCl胁迫过程中的变化趋势一致，都是先上升后下降；NaCl溶液浓度为25 mmol/L时发芽率、发芽势与简易活力指数达到最大，分别比对照提高了11.36%、20.13%和20.04%；随着NaCl溶液浓度升高至200 mmol/L及以上后，华山松种子的各发芽指标急剧降低，而在300 mmol/L时的发芽率、发芽势与简易活力指数仅为对照的23.15%、24.82%和14.30%。

2.1.2 NaCl胁迫对华山松幼苗生长的影响幼苗单株的鲜重和干重反映了植株在生长发育过程中有机物的积累和对水分吸收的能力，可在一定程度上评价幼苗在盐胁迫下的生长发育能力[12-15]。NaCl胁迫对华山松幼苗鲜重的影响结果见图1，对幼苗干重的影响结果见图2。从图1、图2可见，随着NaCl溶液浓度的提高，幼苗的鲜重呈先升高后下降的变化趋势，而幼苗的干重持续下降。其中幼苗的鲜重在NaCl溶液浓度为25 mmol/L时比对照的鲜重增加了7.80%；而在50 mmol/L时幼苗鲜重与对照的鲜重差异不明显。但是在各胁迫浓度下的干重均小于对照，其中在NaCl溶液浓度为300 mmol/L时，幼苗的鲜重和干重比对照分别下降了39.19%和34.16%。另外在试验中发现，NaCl溶液浓度在0～100 mmol/L时，各处理幼苗的外部形态与对照相比目测差异不大；而在200 mmol/L及以上浓度时，幼苗的个体差异很大，高矮很不一致，大多数的幼苗根系呈黄褐色，甚至有的根系发育不完全，出现了许多畸形苗，而且很多种子在发芽过程中就已经死亡，反映出NaCl溶液浓度在100 mmol/L时是个分水岭，高于此浓度后大部分华山松种子或幼苗将无法承受胁迫压力而结束生命。

2.2 NaCl胁迫对华山松幼苗生理生化指标的影响

2.2.1 NaCl胁迫对华山松幼苗可溶性糖含量的影响植物在逆境中通常会在细胞液中积累一些可溶性糖来进行渗透调节，因此该指标常常被作为反映植物抗逆性强弱的指标之一[16，17]，NaCl胁迫对华山松幼苗可溶性糖含量的影响结果见图3。由图3可知，在NaCl胁迫下的幼苗体内可溶性糖含量各处理均高于对照；随着NaCl溶液浓度的提高，华山松幼苗体内可溶性糖含量的变化呈先升高后降低的趋势，以在100 mmol/L时幼苗体内的可溶性糖含量最高，其比对照提高了114.68%。

2.2.2 NaCl胁迫对华山松幼苗叶绿素含量的影响植物主要靠叶绿体进行光合作用，进行干物质的积累，为自身的生长发育提供源源不断的营养与能量，从而在外观上表现出个体长大、成熟等现象[9]。而叶绿体中要靠叶绿素承担收集、传递和转换光能的重任，所以叶绿素含量对于光合作用至关重要，因此在盐胁迫背景下植物叶绿素的含量高低体现了植物抗盐胁迫能力的大小[18，19]，NaCl胁迫对华山松幼苗叶绿素含量的影响结果见图4。由图4可知，华山松幼苗的叶绿素含量变化趋势与可溶性糖含量的变化相似，也是随着NaCl溶液浓度的提高先升高后降低，其中在50 mmol/L时，叶绿素含量达到最大值，比对照的提高了12.46%。

2.2.3 NaCl胁迫对华山松幼苗SOD活性的影响 SOD是生物体内防御活性氧（Reactive oxygen species，ROS）毒性的保护酶，它作为生物体内重要的氧自由基清除剂，能够平衡机体内的氧化物代谢。在正常情况下，植物体内的羟基自由基（·OH）和超氧自由基（O2-·）等ROS的产生与清除处于动态平衡状态之中，如SOD可催化O2-·发生歧化反应而产生H2O2和O2，因而不会伤害植物细胞。但当植物处于盐胁迫逆境时，由于膜脂过氧化使ROS的产生超过了SOD的清除能力，过量的强氧化物质就会引起生物大分子的变性失活，使O2-·迅速增加，膜透性产生剧烈变化，使细胞内的物质外渗加快，加重植物体的损伤。因此SOD的活性体现了植物组织的抗氧化能力，在防御生物体氧化损伤及抵抗盐胁迫等方面起着重要的作用[10，19-21]，所以SOD活性也可视为植物幼苗抗盐胁迫能力大小的指标[22，23]。NaCl胁迫对华山松幼苗SOD活性的影响结果见图5。由图5可知，随着NaCl溶液浓度的升高，华山松幼苗的SOD活性呈现出先升高后降低的变化趋势，如NaCl溶液浓度为50 mmol/L时，SOD活性达到最大，比对照的活性提高了293.51%，此后持续下降。但是各NaCl溶液浓度处理的SOD活性均高于对照，说明华山松幼苗在NaCl胁迫下可以通过提高自身的SOD活性来抵御盐胁迫的不良影响。

2.2.4 NaCl胁迫对华山松幼苗MDA含量的影响 MDA是生物体内膜脂过氧化的最终产物之一，能严重损害植物的细胞膜系统结构、干扰植物正常的生理代谢过程，其含量的高低与植物受害程度直接相关[24]。NaCl胁迫对华山松幼苗MDA含量的影响结果见图6。从图6可以看出，随着NaCl溶液浓度的增加，华山松幼苗的MDA含量变化与可溶性糖含量的变化一样，也是先升高后降低，在NaCl溶液浓度为100 mmol/L时MDA含量达到最大，比对照的含量提高了21.76%，不过在100 mmol/L浓度范围内幼苗的外观形态表现正常。当然此时的细胞膜受害损程度如何，要待以后的显微观察和细胞学鉴定来判断。

3 讨论

试验结果表明，在100 mmol/L的NaCl溶液浓度范围内，华山松种子均能正常发芽，发芽率都在70%以上，发芽势在40%以上，简易活力指数在4.50以上；而且幼苗生长正常，在外观上各处理之间无明显差异。在试验设置的NaCl胁迫浓度范围内，随着NaCl溶液浓度的提高，华山松种子的发芽率、发芽势和简易活力均呈先上升后下降的变化趋势。当NaCl溶液浓度为25 mmol/L时，发芽率、发芽势与简易活力指数均达到最大，分别比无NaCl胁迫的对照提高了11.36%、20.13%和20.04%；随着NaCl溶液浓度升高至200 mmol/L及以上浓度后，华山松种子的3个发芽指标急剧降低，如在300 mmol/L时，华山松种子的发芽率、发芽势与简易活力指数分别仅为对照的23.15%、24.82%和14.30%，并且幼苗生长异常，个体差异很大。这个结果说明低浓度（25 mmol/L）的NaCl溶液可以促进华山松种子发芽与幼苗生长，而高浓度（200 mmol/L及以上）的NaCl溶液会对华山松种子的发芽造成极大的障碍，并严重影响幼苗的生长发育。同时，幼苗的干重随着NaCl溶液浓度的升高而降低，说明幼苗需要消耗体内的部分干物质来启动抗性机制[14，25]；而鲜重先升高后降低说明在一定范围内，幼苗可以通过提高对水分的吸收来稀释体内的NaCl，但当NaCl溶液浓度继续提高时，由于外界水势降低，幼苗就很难通过渗透吸水来达到抵御胁迫的目的[26]，进而造成幼苗的鲜重与干重不断降低。

黄伟业等[27]研究报道，在NaCl胁迫毛竹[Phyllostachys heterocycla（Carr.）Mitford cv. pubescens Mazel ex H.de Lehaie]种子后，随着NaCl浓度的提高，毛竹幼苗的SOD活性先增加后降低，这与本试验的研究结果是一致的；并且华山松幼苗体内的可溶性糖、叶绿素含量变化也呈这一趋势。试验中的SOD活性与可溶性糖含量这2个指标均高于无NaCl胁迫的对照。这说明在一定的NaCl胁迫范围内，华山松幼苗可以通过渗透调节（积累可溶性糖）增强体内抗性酶（SOD）的活性，提高光合作用中光能收集、传递和转化的能力，从而抵御不良环境。但林兰英等[28]认为，植物的这种能力是有限的，随着胁迫的加剧，这些能力会不断下降。

张慧蓉等[29]在研究盐胁迫对野生地肤[Kochia scoparia（L.）Schrad.]幼苗生长的影响时，将中性盐NaCl、Na2SO4和碱性盐NaHCO3、Na2CO3按不同比例混合，模拟出30种与天然盐碱土壤相似的盐含量条件；结果发现，随着混合盐胁迫浓度的升高，MDA的含量在逐渐增加，而本试验的结果表明，华山松幼苗体内的MDA含量随着NaCl溶液浓度的增加表现出先升高后降低的变化趋势，个中原因可能是在高浓度的NaCl伤害时，华山松幼苗的膜伤害不仅仅是膜脂过氧化加剧造成的，还有其他的伤害存在[30，31]；也可能是高浓度的NaCl激活了体内其他抗盐胁迫的途径，当然这需要下一步的试验来验证。

植物在幼苗期是对外界环境最敏感的时期[32]，因此该时期盐胁迫幼苗造成的伤害也是最直接、最严重的[33]。试验通过华山松种子发芽、幼苗生长这短短21 d的观察记录，发现华山松幼苗能在100 mmol/L以内的NaCl溶液浓度范围内正常生长；如此推算，那么华山松成年植株很有可能将会在更高盐浓度环境下正常生长，其耐NaCl胁迫的潜力还是相当可观的；因此加快华山松耐盐胁迫能力的开发对于扩大引种、改良盐碱地是非常有价值的。不过我们仍然需要进一步探讨华山松大苗或者成年植株的盐浓度耐受范围，通过抗盐锻炼、施用植物生长调节物质等方法[34，35]提高华山松的抗盐性，以及通过基因改良、不断选优[36]等方法，使这种优良林木的耐盐胁迫遗传特性持续强化并保留下来，以此推动华山松在我国大片的盐碱地上广为引种栽培；这不但可以对盐碱地积极治理，还可以创造更多的物质财富。

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