一种基于实时荧光聚合酶链式反应的肉及肉制品中猪源性成分含量测定

摘 要：为了建立一种基于实时荧光聚合酶链式反应的肉及肉制品猪源性成分含量测定方法，分别以猪线粒体DNA 的NADH4基因和16S rRNA基因为靶位点设计猪特异性引物、探针和通用引物、探针，建立猪源性成分含量测定方法，通过特异性、灵敏性、线性、准确度及市售肉制品检测，对该方法体系进行检验和评价。结果表明：建立的猪源性成分含量实时荧光聚合酶链式反应测定方法体系具有良好的特异性及灵敏性，最低可检测到0.4pg/μL纯猪肉DNA；无论是猪特异性体系还是通用体系都呈现良好的线性关系 （R2均达到0.999以上） 和较宽的线性范围；通过含猪源性成分的模拟混合肉样检测，样品猪源性成分含量的回收率平均值为122.27%，说明该方法具有较高的准确度；通过市售肉制品检测表明该方法可以用来检测实际样品（包括生鲜样品和熟肉样品）中猪源性成分含量。

关键词：实时荧光聚合酶链式反应；猪源性成分；定量；肉类掺假

Abstract： This study is aimed to establish a real time PCR （RT-PCR） method for quantitative determination of pork-derived ingredients in meat and meat products. The pork-specific primers， universal primers and TaqMan probes were designed for the mitochondrial NADH4 gene and 16S rRNA， respectively， and the established RT-PCR method was evaluated by specificity， sensitivity， linear relationship and accuracy by using it to detect commercial meat products. The method showed a good specificity and was able to detect 0.4 pg/μL pork DNA. Both pork-specific and universal systems showed a good linear relationship （R2 > 0.999） and a wide linear range. The PCR method showed a high accuracy and the average recovery of pork-derived ingredients in meat mixtures was 122.27%. It can be used to test both raw and processed pork products.

Key words： real time PCR； pork-derived ingredients； quantification； meat adulteration

中图分类号：TS207.3 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2013）12-0011-05

近年来，由于价格差异带来的巨大利益诱惑导致肉类食品“掺杂使假”事件频发，不仅严重侵害消费者利益，而且对肉类产业造成了巨大伤害。不仅国内此类事件频发，国际肉类市场也普遍存在肉类食品掺假情况。2013年1月，欧洲暴发的“马肉”风波，多个欧洲国家卷入其中，极大降低了肉类消费信心，也给我国肉类进口带来了极大的安全隐患。

目前，动物源性成分检测技术通常建立在对样品蛋白质、DNA、脂肪酸等分子结构、序列或组成特异性分析的基础上[1]。蛋白质的肉种鉴定方法多采用免疫学技术对肌钙蛋白Ⅰ、h-钙调素结合蛋白等具有物种特异性的物质进行检测来判定样品中是否含有某种肉种成分[2-3]。但蛋白质的肉种鉴定方法具有较大的局限性[4-5]，一般不作为标准制定方法或仲裁鉴定方法，通常作为快速筛查方法使用。与蛋白质分子相比，DNA分子除了具有种内保守性高，种间特异性强的优点外还具有较高的热稳定性，可独立用于物种判别依据。目前，基于DNA序列特异性的鉴别技术中，基于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）的动物源性成分检测技术逐渐成为了发展方向和研究热点，主要包括有PCR-电泳法[6-8]、PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism（RFLP）法[9-11]、PCR测序法[12， 13]、随机引物的扩增法[14]、实时荧光聚合酶链式反应（real-time fluorescent polymerase chain reaction，RT-PCR）法[15-18]等。在众多技术中由于RT-PCR具有灵敏度、准确性和重复性等重要性能参数上无可比拟的优势，成为该领域的研究热点和趋势，是作为仲裁方法和司法鉴定的理想技术类型和现行国家[19]和行业标准[20]中指定的主要方法之一。

目前现有的物种鉴别技术，无论是国家、行业标准还是商业试剂盒，都只能完成定性测定，即只能判定样品中是否含有某种动物DNA成分，结果以阴性或阳性的形式报告。而现实问题是存在掺假的食品中通常是混合制品，例如猪肉串刷上羊油变羊肉串、酱猪肉泡过牛肉膏变牛肉等，多多少少都会含有一定标签主体成分，因此使用现有方法无法区分是无意污染还是故意添加所致，这也是不法分子惯用借口之一，也就无法有效甄别是否存在掺假行为及其严重程度。因此研发出定量检测技术，即肉种掺假量化鉴别技术对解决肉类掺假问题，加强食品保护，保护消费者和相关进口贸易企业利益十分必要，也有巨大市场需求。本实验利用猪特异性

RT-PCR反应和通用体系RT-PCR反应结果的关系，开发一种基于RT-PCR的肉及肉制品中猪源性成分百分含量检测方法，基本实现了猪源成分的量化鉴别，为相关部门解决肉制品掺假问题的定性量刑难题，提供可靠的技术手段和执法依据，具有广阔的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪四号肉 北京资源公司；牛肉 北京御香苑畜牧有限公司；羊肉 内蒙古金戈尔有机畜牧有限公司；狗肉、兔肉、鹿肉、驴肉、鸡肉、鸭肉、鱼肉 市购。

DNA提取主要试剂：裂解液：1% CTAB、0.05mol/L Tris-HCl（pH8.0）、0.7mol/L NaCl、0.01mol/L EDTA （pH8.0）；TE缓冲液（Tris-HCl，EDTA 缓冲液）：10mmol/L、Tris-HCl（pH8.0）、1mmol/L EDTA （pH8.0）；三氯甲烷：异戊醇（24：1，V/V）、异丙醇、70% 乙醇；灭菌双蒸水 北京华力基科技有限公司。

RT-PCR反应试剂：TaKaRa 2×酶体系预混液 大连宝生物工程（大连）有限公司；RT-PCR 96孔板 罗氏诊断产品（上海）有限公司。

1.2 仪器与设备

FSP-625匀浆机 日本Nihonseiki Kaisha公司；BT224S分析天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；S-100 涡旋振荡器 大洋科学工业株式会社；HGDS-250 恒温恒湿试验箱 上海一实仪器设备厂；Eppendorf 5417 C/R 型离心机 艾本德中国有限公司；UV-2800 紫外-可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；GI54DWS 全自动高压灭菌器 美国致微（厦门）仪器有限公司；LightCycler 480 荧光PCR仪 罗氏诊断产品（上海）有限公司等。

1.3 方法

1.3.1 肉类组织DNA提取方法[21]

将肉去筋膜、剪碎，按照肉：水=1：4（m/m）准确称取并进行匀浆，匀浆机转速12000r/min，匀浆时间8min，吸取100μL匀浆液于1.5mL离心管中，加入800μL裂解液，65℃孵育30min，期间不时振荡混匀。12000×g 4℃离心5min，转移600μL上清液于洁净离心管中，加入400μL三氯甲烷：异戊醇（24：1，V/V），振荡混匀后，12000×g 4℃离心5min，取400μL上清液于洁净离心管中，加320μL异丙醇，4℃条件下沉淀30min。12000×g离心5min，弃掉上清液，然后用500μL体积分数70%乙醇溶液洗涤，弃掉上清液，晾干，加入100μL TE缓冲液，4℃过夜，溶解沉淀。通过紫外-可见分光光度计检测DNA的纯度及浓度。

1.3.2 实时荧光PCR检测

1.3.2.1 引物和探针设计

利用Matlab R2007a软件将不同物种线粒体DNA 16S rRNA基因对齐比较，选取物种间序列保守区域运用引物设计软件Oligo 7.0设计通用引物和TaqMan探针，扩增产物长度为125 bp。对不同物种线粒体DNA NADH4基因进行对齐比较，选取物种间序列变异大的区域进行猪特异性引物和探针的设计，扩增产物长度为120 bp。

引物和TaqMan探针由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物和探针序列见表1。

1.3.2.2 RT-PCR反应

RT-PCR扩增反应的10μL反应体系见表2，DNA模板2μL，用灭菌双蒸水补足体系。

PCR反应体系在荧光PCR仪中反应的程序是预变性95℃、30s；变性95℃、10s；退火和延伸60℃、45s；40个循环；最后40℃冷却60s。

1.3.2.3 基于RT-PCR测定样品中猪源性成分含量的方法

提取标准猪肉样品DNA，稀释至少5个浓度梯度作为标准样品，制作标准曲线，浓度跨度范围可根据实际需求调整。

采用表1猪特异性引物和通用引物对待测样品和标准曲线DNA模板，在1个PCR板上的不同反应管同时进行RT-PCR扩增，按照表3进行加样；然后按照公式1计算出待测样品中猪源性成分含量。

3 讨 论

本实验建立的肉及肉制品猪源性成分含量的RT-PCR测定方法具有准确性高，稳定性好，检出限低的优点，但由于整个试验流程包括肉样前处理、DNA提取和RT-PCR检测等主要步骤，所以存在一定相对标准偏差，仍需测定其他肉种成分含量作为主成分定量的辅助判定。

线粒体DNA广泛大量的存在于动物细胞中，并且同时具有高变异性和高保守型区域，因此被认为高度适用于物种鉴别技术[22]。本实验建立的猪源性成分含量测定方法选择线粒体DNA的片段基因作为扩增靶序列，但是，由于不同动物组织含有的线粒体和线粒体DNA的数量差别很大[23]，所以DNA的含量并不能完全代表肉的质量百分比。但通过对不同物种、部位、个体的DNA含量进行大量统计调研，掌握各指标的分布区间，对测定结果进行修订，可以在一定范围内实现方法准确度的提高。

本实验建立的方法体系对熟肉样品进行检测，可能会由于加工过程中高温对肉类DNA造成不同程度的断裂、加工中各种香辛料及调味品的添加等原因，造成测定结果偏低，后续实验中，将针对热加工的温度和时间、扩增靶序列长度、靶序列碱基组成等对DNA片段破坏程度和PCR扩增的影响进行更深入的研究。

4 结 论

本实验研究、建立的以双引物（物种特异性引物和通用引物）为基础的肉及肉制品猪源性成分含量的RT-PCR测定方法体系，最低可检测到0.4pg/μL纯猪肉DNA；无论是猪特异性体系还是通用体系都呈现良好的线性关系（R2均达到0.999以上）和较宽的线性范围；通过含猪源性成分的模拟混合肉样检测，样品猪源性成分含量的回收率平均值122.27%。该方法体系具有准确性高，稳定性好，检出限低等优点，有效解决了无法判断是否具有掺假行为及严重程度的难题，达到了国际先进水平，同时为相关执法部门进一步加强监管、减少掺假、欺诈行为的发生提供了可靠的技术支持和执法依据。

参考文献：

[1] BALLIN N Z， VOGENSEN F K， KARLSSON A H. Species determination-Can we detect and quantify meat adulteration？[J]. Meat Science， 2009， 83（2）： 165-174.

[2] LIU Lihua， CHEN Furchi， DORSEY J L， et al. Sensitive monoclonal antibody-based sandwich ELISA for the detection of porcine skeletal muscle in meat and feed products[J]. Food Science， 2006， 71（1）： M1-M6.

[3] KIM S H， HUANG T S， SEYMOUR T A， et al. Production of monoclonal antibody for the detection of meat and bone meal in animal feed[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2004， 52（25）： 7580-7585.

[4] MYERS M J， YANCY H F， FARRELL D E， et al. Assessment of two enzyme-linked immunosorbent assay tests marketed for detection of ruminant proteins in finished feed[J]. Journal of Food Protection， 2007， 70（3）： 692-699.

[5] MYERS M J， YANCY H F， FARRELL D E， et al. Evaluation of two commercial lateral-flow test kits for detection of animal proteins in animal feed[J]. Journal of Food Protection， 2005， 68（12）： 2656-2664.

[6] MANE B G， MENDIRATTA S K， TIWARI A K. Beef specific polymerase chain reaction assay for authentication of meat and meat products[J]. Food Control， 2012， 28： 246-249.

[7] SOARES S， AMARAL J S， MAFRA I， et al. Quantitative detection of poultry meat adulteration with pork by a duplex PCR assay[J]. Meat Science， 2010， 85（3）： 531-536.

[8] 孙艳华， 张智禹， 牛晋阳， 等. PCR 法快速检测熟肉制品中肉类来源[J]. 食品研究与开发， 2010， 31（5）： 139-142.

[9] MAHAJAN M V， GADEKAR Y P， DIGHE V D， et al. Molecular detection of meat animal species targeting MT 12S rRNA gene[J]. Meat Science， 2011， 88（1）： 23-27.

[10] MAEDE D. A strategy for molecular species detection in meat and meat products by PCR-RFLP and DNA sequencing using mitochondrial and chromosomal genetic sequences[J]. European Food Research and Technology， 2006， 224（2）： 209-217.

[11] 高琳， 徐幸莲， 周光宏. 应用PCR-RFLP 法鉴别肉制品中的猪和牛源性成分[J]. 南京农业大学学报， 2008， 31（2）： 135-138.

[12] IIJIMA K， SUZUKI K， OZAKI K， et al. DNA analysis for identification of food-associated foreign substances[J]. Journal of Food Quality， 2006， 29（5）： 531-542.

[13] GIRISH P S， ANJANEYULU A S R， VISWAS K N， et al. Sequence analysis of mitochondrial 12S rRNA gene can identify meat species[J]. Meat Science， 2004， 66（3）：551-556.

[14] SAEZ R， SANZ Y， TOLDRA F. PCR-based fingerprinting techniques for rapid detection of animal species in meat products[J]. Meat Science， 2004， 66（3）： 659-665.

[15] SOARES S， AMARAL J S， OLIVEIRA M B P P， et al. A SYBR green real-time PCR assay to detect and quantify pork meat in processed poultry meat products[J]. Meat Science， 2013， 94： 115-120.

[16] CHEN Shuangya， ZHANG Jin， CHEN Weiling， et al. Quick method for grouper species identification using real-time PCR[J]. Food Control， 2012， 27： 108-112.

[17] CAMM? C， DOMENICO M D， MONACO F. Development and validation of fast real-time PCR assays for species identification in raw and cooked meat mixtures[J]. Food Control， 2012， 23： 400-404.

[18] DRUMMOND M G， BRASIL B S A F， DALSECCO L S， et al. A versatile real-time PCR method to quantify bovine contamination in buffalo products[J]. Food Control， 2013， 29： 131-137.

[19] 中华人民共和国山东出入境检验检疫局， 中国检验检疫科学研究院， 中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局， 中华人民共和国深圳出入境检验检疫局. GB/T 21101—2007 动物源性饲料中猪源性成分定性检测方法 PCR方法[S]. 北京： 中国标准出版社， 2008.

[20] 中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局， 宝生物工程（大连）有限公司， 中国检验检疫科学研究院. SN/T 2051—2008 食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法： 实时PCR法[S]. 北京： 中国标准出版社， 2008.

[21] 周彤， 李家鹏， 田寒友， 等. 一种提取肉类总DNA的方法： 改良CTAB法[J]. 肉类研究， 2011， 25（12）： 22-24.

[22] BROWN W M， GEORGE M， WILSON A C. Rapid evolution of animal mitochondrial DNA[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 1979， 76（4）： 1967-1971.

[23] ROBIN E D， WONG R. Mitochondrial DNA molecules and virtual number of mitochondria per cell in mammalian cells[J]. Journal of Cellular Physiology， 1988， 136（3）： 507-513.