外源蛋白酶对黔式腊肉风味的影响

朱建军　王晓宇　胡萍　宋朱谕

摘 要：在黔式腊肉加工过程中，通过注射添加木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，促进蛋白质降解，以利于风味物质的形成。结果表明：黔式腊肉最优酶解条件为木瓜蛋白酶添加量0.001%、中性蛋白酶添加量0.001%、食盐添加量4%、酶解时间48h；添加蛋白酶样品中非蛋白氮（NPN）、氨基态氮（AN）、挥发性盐基氮（TVBN）的含量以及游离氨基酸（FAA）种类和总量均高于未加酶样品；经GC-MS检测，添加蛋白酶样品中有65种挥发性风味物质，比未添加蛋白酶样品多10种，风味物质种类除烃类和羰基类化合物外，都有所增加，烃类、酚类和醇类相对含量增加，酯类相对含量减少。

关键词：黔式腊肉；木瓜蛋白酶；中性蛋白酶；风味物质

中图分类号：TS251.6 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2013）08-0016-05

黔式腊肉作为我国传统肉制品的重要组成部分及典型代表，因其色泽美观、香气浓郁、味道独特而著称。传统工艺由于加工工艺落后、生产周期长、受季节限制大等问题[1]，正逐渐被现代腊肉加工工艺代替，但是现代工艺生产的腊肉风味不及传统工艺浓郁。为此，研究人员对低盐处理、紫外辐照和臭氧处理等工艺进行了研究，以期促进腊肉风味的形成及改善[2-3]。

生物酶对腊肉风味的形成有着重要的作用，它能够促进蛋白质水解以及脂肪的水解及氧化，生成肽、游离氨基酸、游离脂肪酸等重要的风味前体物质。由于内源酶作用机理较复杂，影响因素较多[4-9]，多数研究者从外源酶着手研究其对肉制品风味的影响。Fernández等[10]将胰脂酶添加到发酵香肠中，发现其可以促进风味的形成，还可以缩短成熟时间；罗珺等[11-12]分别将木瓜蛋白酶、胰蛋白酶添加到腊肉中，提高了游离氨基酸和风味物质的含量；闫文杰等[13]从猪肉中提取组织蛋白酶和脂肪酶添加到腊肉原料肉中，大部分风味物质都有所增加；田怀香等[14]采用Protaxnex和Flavourzyuie酶组合水解金华火腿制备提取物，得到产品风味较佳；穆建稳等[15]将中性蛋白酶添加到腊牛肉中，促进了蛋白质的降解。但是关于向黔式腊肉中添加酶制剂还未见研究，本研究向黔式腊肉中添加木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，并进行优化组合，在较短时间内使蛋白质降解，促进腊肉独特风味的形成。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜猪肉 贵州黔五福食品有限公司；木瓜蛋白酶（酶活105U/g）、中性蛋白酶（酶活105U/g） 北京索莱宝科技有限公司；其他实验试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

ZSJ型盐水注射器、GR50型真空滚揉机 诸城市双春包装机械公司；KYXX型烟熏炉 嘉兴市凯斯不锈钢机械制造有限公司；FA2004N型电子天平 上海菁海仪器有限公司；78-1型磁力搅拌器 金坛市华峰仪器有限公司；L-8800型氨基酸自动分析仪 日本日立公司；HP6890-5975C型GC-MS联用仪 美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 黔式腊肉加工工艺

鲜肉切块→腌制（木瓜蛋白酶、中性蛋白酶溶解于盐水，注射到猪肉中，真空滚揉30min后干腌3d）→烘烤、烟熏（70℃烘烤3h后烟熏24h）→自然风干（24h）→真空包装得成品。

1.3.2 取样

在腊肉生产过程中分别于原料肉（A样）、腌制结束（B样）、熏烤结束（C样）、自然风干24h后的成品（D样）工艺点随机取相同质量的样品，每次每个工艺点取样500g，取出的样品待用。

1.3.3 总氮、非蛋白氮、氨基态氮及挥发性盐基氮的测定

总氮测定（total nitrogen，TN）：参照GB 5009.5—2010《食品安全国家标准：食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法；非蛋白氮的测定（non-protein nitrogen，NPN）：参照赵改名等[16]的方法；氨基态氮（amino nitrogen，AN）的测定：参照文献[17]；挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen）测定：参照GB/T 5009.44—2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》中半微量定氮法。

1.3.4 游离氨基酸测定

称取样品1.00g加入到50mL水中，振荡混匀，取出4mL溶液，加入到4mL 100g/L磺基水杨酸溶液中沉淀12h，10000r/min离心25min，取一定体积的上清液调至pH2左右，用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液上机用自动氨基酸分析仪测定。

色谱条件：离子交换柱：2.6mm×150mm；可见光检测器：波长570nm、440nm；流动相：柠檬酸和柠檬酸钠缓冲液；流速：0.225mL/min；进样量：50μL。

1.3.5 挥发性风味物质的测定

称取样品10g，切碎后置于50mL固相微萃取仪采样瓶中，插入装有2cm-50/30μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纤维头的手动进样器，在85℃顶空萃取30min取出，快速移出萃取头并立即插入气相色谱仪进样口（温度250℃）中，热解吸3min进样。

气相色谱条件：色谱柱为ZB-5MSI 5% Phenyl-95% DiMethylpolysiloxane（30m×0.25mm，0.25μm）弹性石英毛细管柱，柱温45℃（保留2min），以4℃/min升温至220℃，保持2min；汽化室温度250℃；载气为高纯He （99.999%）；柱前压53kPa，载气流量1.0mL/min；不分流进样；溶剂延迟时间：1.5min。

质谱条件：离子源为（electron ionization，EI）源；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70eV；发射电流34.6μA；倍增器电压1216V；接口温度280℃；质量范围m/z 20～450。

1.3.6 感官评定

由实验室10人组成感官评定小组。以色泽（表面、内部以及整体）、质地（表面、内部）、口感（咸度、甜度及硬度）和风味（烟熏味及腊香味）作为感官评定的指标。采用九点标度法[18]，满分9分，9=极好，8=良好，7=好，6=次好，5=一般，4=一般以下，3=差，2=很差，l=极差。

2 结果与分析

2.1 黔式腊肉酶解工艺优化

图 1 各单因素对黔式腊肉风味的影响

Fig.1 Effect of different dosages of papain and neutral protease， salt content and hydrolysis time on the sensory score of Guizhou bacon

分别对木瓜蛋白酶添加量、中性蛋白酶添加量、食盐添加量和酶解时间进行单因素试验，结果见图1。由单因素试验结果初步确定，选择木瓜蛋白酶添加量0.001%、中性蛋白酶添加量0.001%、食盐添加量4%、酶解时间36h。

在单因素试验的基础上，结合感官评定得分以及氨基态氮含量，确定两种蛋白酶添加量（g酶/g肉）、食盐添加量和酶解时间，进行正交试验，结果如表1所示。以黔式腊肉中氨基态氮含量为评定指标，由极差分析可得出影响其酶解的因素主次顺序为：A木瓜蛋白酶添加量>B中性蛋白酶添加量>C食盐添加量>D酶解时间，最优酶解条件为A3B3C2D3，即木瓜蛋白酶添加量0.005%、中性蛋白酶添加量0.005%、食盐添加量4%、酶解时间48h。经实验验证，此时氨基态氮含量为318.72mg/100g。以感官评定得分为评定标准，经极差分析得出黔式腊肉最优酶解条件为A2B2C3D3，即木瓜蛋白酶添加量0.001%、中性蛋白酶添加量0.001%、食盐添加量6%、酶解时间48h。虽然食盐在腊肉加工储藏过程中具有抑菌防腐作用，添加蛋白酶能促进蛋白质水解，但是盐分含量过高对健康不利，蛋白酶添加量过高产品感官欠佳并且会提高经济成本。综合考虑影响黔式腊肉酶解的因素，最优酶解条件为A2B2C2D3，即木瓜蛋白酶添加量0.001%、中性蛋白酶添加量0.001%、食盐添加量4%、酶解时间48h。在此条件下所得黔式腊肉产品整体色泽鲜明、口感和质地较好、腊香味明显。

2.2 酶解工艺优化腊肉与未加酶处理腊肉的比较分析

2.2.1 非蛋白氮含量比较

非蛋白氮是除蛋白质以外的多肽、短肽及游离氨基酸等小分子含氮物质，是重要的风味前体物质，能够直接反映出腊肉中蛋白质的降解程度。由图2可看出，未加酶与加酶的样品，非蛋白氮含量在加工过程中都呈上升趋势，由原料肉的0.55%分别上升到1.53%和3.02%，这是黔式腊肉加工过程中蛋白质发生降解的结果。未加酶的样品在腌制结束后非蛋白氮含量下降，是由于腌制阶段非蛋白氮随着盐水的渗出而流失。添加蛋白酶的样品非蛋白氮的含量高于未添加蛋白酶的样品，并且差异显著（P<0.05），这与加入蛋白酶促进了蛋白质分解生成多肽以及氨基酸有关。

图 2 黔式腊肉加工过程中非蛋白氮变化

Fig.2 Change in NPN content during Guizhou bacon production

2.2.2 氨基态氮含量比较

氨基态氮主要来自于蛋白质和多肽的降解，在一定程度上也能够反映出蛋白质的水解程度，水解产物氨基酸是腊肉中重要的风味前体物质，对腊肉的风味有重要影响。由图3可知，在黔式腊肉加工过程中，未加酶与加酶样品氨基态氮均呈上升趋势。加酶后氨基态氮含量由原料肉的150.24mg/100g上升到成品的281.51mg/100g，增加了1.87倍，比未加酶成品的含量高57.86mg/100g。在腌制阶段，未加酶样品氨基态氮含量随盐水流失而下降，加酶样品中氨基态氮虽有流失但含量依然显著增加，这是由于添加蛋白酶的样品在腌制阶段蛋白质剧烈水解，之后的过程中外源蛋白酶活性逐渐降低。

图 3 黔式腊肉加工过程中氨基态氮变化

Fig.3 Change in AN content during Guizhou bacon production

2.2.3 挥发性盐基氮含量比较

挥发性盐基氮是蛋白质分解生成的氨及胺类等碱性含氮物质，其含量标志着肉及肉制品的腐败变质程度。由图4可看出，两种样品在加工过程中，挥发性盐基氮都在不断上升，未加酶和加酶样品的挥发性盐基氮由原料肉的6.26mg/100g分别上升到成品的16.54mg/100g和20.42mg/100g，并且腌制阶段上升速率较快。在整个加工过程中，加酶样品的挥发性盐基氮含量均高于未加酶样品，这是由于添加蛋白酶加快了氨基态氮和多肽氮的生成速度，在一定程度上促进了挥发性盐基氮的产生[19]。

图 4 黔式腊肉加工过程中挥发性盐基氮变化

Fig.4 Change in TVBN content during Guizhou bacon production

2.2.4 游离氨基酸比较

腊肉样品中添加蛋白酶，能够促进蛋白质降解生成游离氨基酸，游离氨基酸又可以进一步反应形成挥发性风味物质[20]。因此游离氨基酸含量能反应出腊肉中蛋白质降解程度以及风味特征。由表2中未加蛋白酶的样品与添加蛋白酶的样品游离氨基酸含量对比可知，添加外源蛋白酶后，游离氨基酸的总含量增加，比未加蛋白酶的样品增加了30.98%。大多数游离氨基酸的含量都有所增加，其中以组氨酸增加最多，其次是酪氨酸、谷氨酸和赖氨酸。此外，添加蛋白酶样品中检测出缬氨酸，且含量较高（120.6mg/100g），这在未加蛋白酶样品中未检测到。天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、赖氨酸和组氨酸的含量与肉制品的风味密切相关，添加外源蛋白酶后，这几种游离氨基酸的含量都有所增加，有利于黔式腊肉风味的形成。添加蛋白酶后，必需氨基酸由6种增加到7种，总含量415.04mg/100g增加到640.69mg/100g，腊肉产品的营养价值也有一定程度的提高。

2.2.5 风味成分比较

经SPME-GC-MS检测分析，得出黔式腊肉未加酶与加酶样品挥发性风味物质成分及相对含量结果见表3。未添加蛋白酶与添加蛋白酶样品的主体风味物质为醇类、烃类、酚类、酯类和羰基化合物，添加蛋白酶样品中共鉴定出65种挥发性风味物质成分，比未添加蛋白酶样品多10种，这说明添加外源蛋白酶促进了蛋白质降解，生成更多的游离氨基酸，进而促进挥发性风味物质的形成。

挥发性风味物质种类及相对含量分析结果见表4。添加蛋白酶后，风味物质种类除烃类和羰基类化合物外，都有所增加。其中，酚类、醇类和其他类化合物增加3种，酸类增加2种，酯类增加1种。对风味物质相对含量而言，烃类、酚类和醇类分别增加了3.87%、3.72%和2.76%，酯类减少了10.11%，羰基类、酸类和其他类化合物变化不大。

3 结 论

3.1 由木瓜蛋白酶和中性蛋白酶组合酶解正交试验结果得出黔式腊肉最优酶解条件为：木瓜蛋白酶添加量0.001%、中性蛋白酶添加量0.001%、食盐添加量4%、酶解时间48h。

3.2 添加蛋白酶样品，非蛋白氮、氨基态氮、挥发性盐基氮的含量以及游离氨基酸种类和总量均高于未加酶样品，加入蛋白酶促进了蛋白质降解以及风味物质的形成。

3.3 添加蛋白酶样品中共鉴定出65种挥发性风味物质成分，比未添加蛋白酶样品多10种。添加蛋白酶后，风味物质种类除烃类和羰基类化合物外，都有所增加。烃类、酚类和醇类相对含量增加，酯类相对含量减少，羰基类、酸类和其他类化合物变化不大。

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