黑豆过氧化物酶的酶学特性研究

安徽农业大学生命科学学院 张宽朝 阮飞 李成 文汉＊

黑豆为豆科植物的种子，含有丰富的蛋白质、卵磷脂、脂肪、维生素、黑色素及烟酸等，具有医食同疗的重要生理功能（王敏等，2008）。过氧化物酶（POD）是一类广泛存在于各种植物、动物和微生物体内的氧化还原酶，能够催化过氧化氢和有机过氧化物对各种有机物和无机物的氧化作用，参与细胞代谢的氧化还原过程（罗龙海等，2008；田国忠和李怀芳，2001）。本试验对黑豆中的过氧化物酶进行酶学特性的研究，以期为进一步研究过氧化物酶的基本特性、调控黑豆的加工过程、拓展过氧化物酶的获取渠道提供理论参考和试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 黑豆：庐州黑豆，市售，粉碎机破碎，备用；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、愈创木酚、EDTA、Tris、氢氧化钠、氯化钠、考马斯亮蓝 G-250等均为国产分析纯；SP-722E分光光度计（上海光谱仪器有限公司）、TGL-20M台式高速冷冻离心机（湘仪离心机仪器有限公司）、MC99-3自动液相色谱分离层析仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）、粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 POD酶活性测定及活性单位 采用愈创木酚法测量酶活力。此方法主要是利用有过氧化氢存在条件下，POD能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在470 nm处有最大光吸收，测量吸光度值并计算酶活力。

POD活性测定参考文献的方法，略有不同（Amako等，1994）。测定系统为4 mL，包括l mL 40 mmol/L 愈创木酚，l mL 40 mmol/L H202，1.9 mL 0.2 mol/L磷酸缓冲液（pH6.O），30℃水浴预热。加入0.1 mL酶液于30℃反应5 min，波长470 nm下测定OD值。

POD活力单位定义为 ：每分钟OD值变化0.001为一个酶的活力单位（U）。

1.2.2 酶学特性研究

1.2.2.1 粗酶液的提取 准确称取豆壳粉末4 g，放入研钵，放少许石英砂，加入0.2 mol/L pH值为6.0的磷酸缓冲液160 mL进行研磨，室温下抽提24 h后，将粗提液经脱脂纱布过滤，再经10000 r/min离心15 min，上清液即为粗酶液。

1.2.2.2 酶的最适pH 按1.2.1酶活测定体系，分别加入 pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、40 mmol/L 愈创木酚，40 mmol/L H202，摇匀，30℃水浴预热，加入酶液，于30℃恒温反应5 min，迅速取出测定酶活性，绘图确定酶的最适pH。

1.2.2.3 酶的最适温度 按1.2.1酶活测定体系，分别加入40 mmol/L愈创木酚，40 mmol/L H2O2，0.2 mol/L 磷酸缓冲液（pH6.O），摇匀，30 ℃水浴预热，加入酶液，分别于 25、30、35、40、45、50 ℃准确恒温反应5 min，迅速取出测定酶活性，绘图确定酶的最适温度。

1.2.2.4 愈创木酚浓度对酶反应的影响及其表观Km 在最适温度下，分别加入5、10、20、40 mmol/L愈创木酚，40 mmol/L H2O2，0.2 mol/L磷酸缓冲液（pH6.O），摇匀，30 ℃水浴预热，加入酶液，准确恒温反应5 min，迅速取出测定酶活性，按Lineweave Burk法采用双倒数法作图。

1.2.2.5 过氧化氢浓度对酶反应的影响及其表观Km 在最适温度下，分别加入40 mmol/L愈创木酚，0.5、1、5、10、20、40 mmol/L H2O2，0.2 mol/L 磷酸缓冲液（pH6.O），摇匀，30℃水浴预热，加入酶液，准确恒温反应5 min，迅速取出测定酶活性，按Lineweave Burk法采用双倒数法作图。

1.2.2.6 金属离子对POD活性的影响 按1.2.1酶活测定体系， 分别加入 0.5、1.0、1.5、3.0 mg/mL含 MgSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、AlCl3、NaCl、KCl 0.2 mol/L pH 6.0的磷酸盐缓冲液，40 mmol/L愈创木酚，40 mmol/L H202，摇匀，30 ℃水浴预热，加入酶液，恒温反应5 min，迅速取出测定酶活性。

1.2.2.7 常见化合物对POD活性的影响 按1.2.1酶活测定体系分别加入0.5、1.0、1.5 mg/mL含抗坏血酸（维生素C）、柠檬酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）0.2 mol/L pH 6.0的磷酸盐缓冲液，40 mmol/L愈创木酚，40 mmol/L H202，摇匀，30℃水浴预热，加入酶液，恒温反应5 min，迅速取出测定酶活性。

1.3 数据处理与分析 试验数据以Excel 2003作图。

2 结果与分析

2.1 POD最适pH 由图1可见，随着缓冲液pH逐渐增大，黑豆POD的活性呈先升高后降低的趋势，pH为5.0时酶活最高，因此POD的最适pH为5.0，，在酸性范围内。这与莲藕、枇杷果肉、小麦种子POD的最适pH相同，与甘蔗苗、豆壳和草莓果实、荔枝果皮POD最适pH相近（庞学群和段学武，2004）。

2.2 POD最适温度与温度耐受性 从图2可见，温度为20～30℃时，酶活性随着温度的升高而逐渐上升，究其原因可能是，适度提高温度，有利于酶朝着有利于底物发生作用的催化构象转变。当温度为30℃时，黑豆POD的酶活性最高。随着温度的进一步升高，会破坏酶的活性构象，酶活性呈不断下降的趋势。因此，黑豆POD的最适反应温度是30℃，比莲藕、荔枝果皮和枇杷果肉、豆壳、小麦种子略低，但与草莓果实一致 （王志兵等，2010；罗龙海等，2008；阙瑞琦等，2007；庞学群和段学武，2004）。

2.3 黑豆POD Km 由图3可见，Km即为直线在X负轴上截距的负倒数。根据计算可得：黑豆过氧化物酶对愈创木酚和过氧化氢的表观Km值分别为0.49 mmol/L和0.62 mmol/L，说明，黑豆的POD与愈创木酚和过氧化氢的亲和力较大。

2.4 金属离子对POD活性的影响 以磷酸盐缓冲液内含金属离子作为反应体系，测定不同金属离子对黑豆POD活性的影响，结果见图4。从图4可见，在供试浓度范围内，外源Cu2+的加入，均能够激活 POD 酶活性， 而 Mg2+、Al3+、K+、Na+对酶活性均有一定程度的抑制作用。

2.5 化合物对POD活性的影响 以磷酸盐缓冲液内含抗坏血酸（维生素C）、柠檬酸、EDTA、EDTANa24种常见POD化合物作为反应体系，测定不同化合物对黑豆POD活性的影响，结果见图5。从5图可见，在供试浓度范围内，抗坏血酸、柠檬酸、EDTA、EDTA-Na2均对黑豆POD活性具抑制作用。

3 结论

试验针对黑豆中对豆乳粉、豆奶营养价值和感官质量影响均较大的过氧化物酶进行了酶学特性的研究，以期为黑豆产品的深加工和综合利用与开发提供理论参考。结果表明，POD最适pH为5.0，最适反应温度30℃，对愈创木酚和过氧化氢的表观Km值分别为0.49 mmol/L和0.62 mmol/L，在供试浓度范围内，Cu2+可激活POD酶活性，Mg2+、Al3+、K+、Na+对酶活性有抑制作用，而维生素C、柠檬酸、EDTA、EDTA-Na2均是黑豆POD的抑制剂。

[1]王敏，李丹，李荣和，等.黑豆营养价值及功能特性应用的研究与进展[J].长春大学学报，2008，18（2）：104 ～ 107.

[2]田国忠，李怀芳.植物过氧化物酶研究进展[J].武汉植物学研究，2001，19（4）：332 ～ 344.

[3]罗龙海，范三红，张美祥，等.小麦种子过氧化物酶的纯化及其部分酶学性质[J].农业生物技术学报，2008，16（1）：181 ～ 182.

[4]庞学群，段学武.荔枝果皮过氧化物酶的纯化及部分酶学性质研究[J].热带亚热带植物学报，2004，12（5）：449 ～ 454.

[5]王志兵，赵杨，邱志举，等.豆壳过氧化物酶的酶学性质研究[J].长春工业大学学报（自然科学版），2010，31（5）：506 ～ 510.

[6]阙瑞琦，张丽丽，郭小路，等.莲藕过氧化物酶的分离纯化及性质研究[J].西南大学学报（自然科学版），2007，29（12）：63 ～ 67.

[7]Amako K，Chen G X，Asada K.Separate assay specific for ascorbate peroxidase and guaiacol peroxidase and for the chloroplastic and cytosolic isozymes of ascorbate peroxidase in plants[J].Plant Cell Physiol，1994，35：497 ～ 504.