卫星搭载对苜蓿突变株蛋白表达的影响

李 红，李 波，李雪婷，王 烨，杨蔚然，杨伟光，杨 曌

(1.黑龙江省畜牧研究所，黑龙江 齐齐哈尔 161000； 2.齐齐哈尔大学生命科学与农林学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

紫花苜蓿(Medicagosativa)是一种豆科苜蓿属多年生草本植物，具有较强的抗寒、抗旱、耐盐碱等特点[1]。利用太空特殊环境(高真空、宇宙高能离子辐射、宇宙磁场、高洁净)的诱变作用，使苜蓿种子产生变异，再返回地面选育新种子、新材料。太空育种具有有益变异多、变幅大、稳定快，以及高产、优质等特点[2-4]。其变异率较普通诱变育种高3～4倍，后代会出现各种变异，对植物的形态学性状、物质代谢、染色体、细胞亚显微、超微结构和蛋白质表达差异等各个方面均可产生影响[5-6]，可获得一定的突变体。随着功能基因组学的兴起，蛋白质组学技术方法在植物抗逆性研究中的应用日益广泛和深入，主要集中在对胡萝卜(Daucuscarotavar．sativa)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、云杉(Piceaasperatat)和野棉花(Anemonevitifolia)等体胚发生模式植物的蛋白表达谱和特异分子量等电点研究[3]，而对于苜蓿蛋白质组学的研究报道较少[7-9]。双向电泳作为蛋白组学研究中的核心技术之一，本研究探索了紫花苜蓿蛋白质样品的制备，以及采用双向电泳分离蛋白质组分的适宜条件, 建立紫花苜蓿双向电泳体系，以期为研究紫花苜蓿在空间环境条件下蛋白质差异表达奠定基础。

1 材料与方法

1.1试验材料 2008年收获的紫花苜蓿种子于2008年10月15日-11月2日期间，经由返回式科学与技术试验卫星搭载，经过17 d的空间诱变处理后返回地面，种植于齐齐哈尔大学生物园。以形态和生理上筛选出卫星搭载苜蓿突变株系1L-4(正向突变)、6L-5(负向突变)，其中正向突变为各项形态指标如株高、叶长、叶宽等较对照都不同程度的增高增大，生理指标如脯氨酸、丙二醛等较对照都有不同程度的优化；负向突变则相反。取突变株系与对照植株叶片为材料(图1)。

1.2双向电泳蛋白质提取及蛋白质定量 采用TCA-丙酮沉淀法提取苜蓿蛋白干粉。取适量蛋白质干粉，按1∶25的质量比例与蛋白质裂解液混匀，台式振荡器振10 min，超声促溶20 min，室温静置4 h以上，于12 000 r·min-1离心15 min，吸取上清进行蛋白质定量和进一步试验。用Bradford’s方法测定蛋白质浓度，以BSA作标准。定量后的蛋白质样品分装成小包装保存于-80 ℃备用[10-11]。

1.3蛋白质双向电泳 采用PROTEAN IEF等电聚焦系统。第一向使用 7 cm pH 3～10固相线性IPG干胶条。等电聚焦程序：250 V，1 h；500 V，4 h；4 000 V，3 h；4 000 V，20 000 vhr；500 V，任意时间。第二向使用12%的SDS-PAGE 胶。试验步骤参照Bio-Rad试验指南进行。主动水化19 h，以电压梯度(250 V 除盐1 h，500 V 除盐4 h，4000 V升压3 h)进行电泳，最后达到20 000 V进行等点聚焦。7 cm 胶条上样量400 μg。等电聚焦结束后，立即进行胶条的平衡，平衡缓冲液包括Tris-HCl，2%的SDS，6 mol·cm-1的尿素和20%的甘油，胶条平衡时间为15 min。

图1 供试紫花苜蓿材料Fig.1 Alfalfa materials in this study

试验采用浓度12%的聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质从第一向等点聚焦到第二向SDS-PAGE凝胶的转移时要尽量避免产生蛋白质斑点的脱尾和大分子量蛋白质的丢失，在初步电泳时要缓慢进行(场强<10 V·cm-1)。开始进样时用低电流10 mA·gel-1，待前沿溴酚蓝指示剂走出IPG胶条1 cm并在分离胶中浓缩成一条线后，再加大电流到20～30 mA·gel-1。电泳结束后凝胶用CBB-R250染色液染色过夜，然后用脱色液脱色至凝胶背景清晰透明[12-13]。

1.4凝胶的图像分析 染色后的凝胶放在Powerlook 2100XL UMAX扫描仪上，获得扫描图像，经过ImageMaster 2D Piatinum 6.0 双向电泳图像分析软件进行分析，获得蛋白质斑点的相对表达丰度、分子量和凝胶之间蛋白质斑点匹配的信息等。

2 结果

本研究采用Bradford’s方法测定蛋白质浓度后，经过双向电泳凝胶分离和CBB-R250染色，每块胶上大约有100个可重复的、肉眼可见的蛋白质点。大部分蛋白质点在凝胶上的相对位置和丰度变化不明显。

2.1搭载株系2DE 凝胶匹配 对照共检测出101个蛋白质点(图2)，突变株系1L-4共检测出112个蛋白质点(图3)，突变株系6L-5共检测出96个蛋白质点(图4)，从电泳图上可以看出蛋白质点最多的是在pH 4～7，点的数量占全部蛋白质点的80%，在后续试验中可以优先选用pH 4～7 IPG胶条，3幅图谱中高分子量的蛋白质点都相对稀少，可能是由于提取过程中没有加蛋白酶抑制剂，使高分子量蛋白质降解的缘故。

图2 对照双向电泳图谱(A)与软件检测图谱(B)Fig.2 2D-PAGE map(A) and software testing map(B) of control

图3 1L-4双向电泳图谱(A)与软件检测图谱(B)Fig.3 2D-PAGE map(A) and software testing map(B) of 1L-4

图4 6L-5双向电泳图谱(A)与软件检测图谱(B)Fig.4 2D-PAGE map(A) and software testing map(B) of 6L-5

2.2差异蛋白斑点表达量分析 将检测出的蛋白质斑点通过图像分析软件进行斑点数据分析，得到蛋白质相对丰度梯状图(图5-8)。突变株系1L-4与对照共有23个蛋白质斑点在表达量上发生了改变(图5)，其中6个蛋白质斑点表达量下调，17个蛋白质斑点表达量上调(图5)，对照与突变株系6L-5共有35个蛋白质斑点在表达量上发生了改变，其中17个蛋白质斑点下调(图6)，18个蛋白质斑点上调(图6)。

3 讨论

空间环境的微重力、高辐射等因素会直接穿透植物细胞膜，直接改变细胞内的基因结构和功能，进而会影响到蛋白质的表达，新的蛋白质或者蛋白质表达量上的改变，这些蛋白质的产生是植物适应空间环境的机制，也是机体抵御空间环境诱变的保护性措施。通过对双向电泳对差异蛋白质斑点的分析，有助于揭开空间环境诱变的机制。

本研究发现大部分的蛋白质斑点都集中在pH 4～7中，这为以后的试验奠定了基础，但高分子量的蛋白质点都相对稀少，蛋白质点的分离还不够理想，如果在今后的研究中改用更长的IPG干胶条和运用银染来提高分辨率，可以提高斑点的数量，则有可能获得更加理想的试验结果，为质谱分析做前期准备。

本研究主要关注的是苜蓿蛋白质图谱中相比于对照上调和下调更明显的蛋白质点，以往关于这方面的研究主要包括植物耐逆性生理生态，以及借助转基因手段提高植物的耐逆性等。近年来，随着双向电泳技术的发展和质谱鉴定技术的提高，蛋白质组学已经取得了长足的发展，在植物耐逆性研究中的应用也日益增加。目前,紫花苜蓿蛋白质组学研究鉴定得到一些盐逆境应答蛋白[14-15]。苜蓿是一种具有突出耐逆能力的植物，以它为材料进行结构及蛋白水平上的耐盐机理研究，既能为植物抗逆性的改良提供新基因资源，又可为不同物种间耐逆性的比较基因组学的进一步阐明奠定基础。

图5 1L-4表达量发生改变的蛋白质Fig.5 Change of protein expression quantity of 1L-4

图6 6L-5表达量发生改变的蛋白质Fig.6 Changes of protein expression amount of 6L-5

图7 1L-4表达量发生改变的蛋白质Fig.7 Change of protein expression quantity of 1L-4

图8 6L-5比对照表达量改变的蛋白质斑点Fig.8 Change of protein expression quantity of 6L-5

4 结论

通过卫星搭载的苜蓿突变株系差异蛋白质组学的分析，获得突变株系的蛋白质表达图谱，蛋白质图谱及其蛋白表达量与对照产生了较大的差异，表明空间环境可能促使其基因结构的改变，进而影响到了蛋白质的表达。

[1] 王鑫,马永祥,李娟.紫花苜蓿营养成分及主要生物学特征[J].草业科学，2003,20(10)：39-40.

[2] 刘录祥,王晶,金海强,等.零磁空间诱变小麦的生物学效应研究[J].核农学报,2002,16(1):12-17.

[3] 薛淮,刘敏.植物空间诱变的生物效应及其育种研究进展[J].生物学通报,2002,37(11):7-9.

[4] 张蕴微,韩建国,任卫波,等.植物空间诱变育种及其在牧草上的应用[J].草业科学,2005,22(10):59-63.

[5] Baba A I,Nogueira F C S,Pinheiro C B,etal.Proteome analysis of secondary somatic embryogenesis in cassava (Manihotesculenta)[J].Plant Science,2008,175:717-723.

[6] Song X,Ni Z F,Yao Y Y,etal.Wheat(Triticumaestivum) root proteome and differentially expressed root proteins between hybrid and parents[J].Proteomics,2007,7:3538-3557.

[7] 任卫波,徐柱,陈立波,等.紫花苜蓿种子卫星搭载后其根尖细胞的生物学效应[J].核农学报,2008,22(5):566-568.

[8] 梁宇,荆玉祥,沈世华.植物蛋白质组学研究进展[J].植物生态学报,2004,28(1):124-129.

[9] 郭晋隆,叶冰莹,黄庆煌,等.甘蔗叶片总蛋白提取及双向电泳条件的改进[J].生物技术通报,2008(5):112-125.

[10] 谢锦云,李小兰,陈平,等.温敏核不育水稻花药蛋白质组初步分析[J].中国生物化学与分子生物学报,2003,19(2):215-221.

[11] 何瑞锋,丁毅,张剑锋,等.植物叶片蛋白质双向电泳技术的改进与优化[J].遗传,2000,22(5):319-321.

[12] 王继红,陈绍宁,白冰,等.人工老化对玉米种子蛋白质组的影响[J].河南农业大学学报,2009,43(3):232-235.

[13] 汪家政,范明.蛋白质技术手册[M].北京：科学出版社,2000:42-46.

[14] 任卫波,赵亮,王蜜,等.苜蓿种子空间诱变生物学效应研究初报[J].安徽农业科学，2008,36(32):14039-14041.

[15] 熊军波.紫花苜蓿响应盐胁迫蛋白组研究[D].北京：中国农业科学院, 2007.