“健脾”中药对急性运动大鼠线粒体呼吸链复合体的影响

2013-04-25李燕舞阿拉木斯

成都体育学院学报 2013年5期

李爽，李燕舞，王蕾，阿拉木斯

(1.广州大学体育学院，广东广州 510006;2.广州中医药大学，广东广州 510405)

运动中的能量供应、运动能力的保持以及运动训练引起人体机能水平的提高等均与线粒体功能变化密切相关［1］。关于线粒体功能的研究已成为运动科学领域中的重要方面。在不同运动状态下，骨骼肌线粒体功能改变已有大量研究，多集中在线粒体钙代谢、膜脂质过氧化、膜流动性、氧化磷酸化功能改变等方面，提示急性运动力竭状态的产生与线粒体呼吸链损害有关［2］。线粒体内膜呼吸链是由四个跨膜蛋白复合体(线粒体呼吸链膜蛋白复合体 I、II、III、和 IV)、介于 I、II与III之间的泛醌(Q)以及介于III与IV之间的细胞色素C(Cyt－C)共同组成，它们共同完成了线粒体氧化磷酸化过程［3，4］。线粒体呼吸链复合体的功能变化能直接或间接地反映线粒体的呼吸功能变化。提高线粒体呼吸链复合体活性可起到保护线粒体膜结构的作用，维持呼吸链的完整性，改善其氧化磷酸化功能，对促进有氧供能和提高运动能力具有较大的实用价值。因此，本研究在中医“脾主肌肉”的理论指导下，采用健脾中药补中益气丸对急性大强度运动大鼠进行预防性干预，观察其骨骼肌、肝脏线粒体呼吸链复合体活性的变化，进一步探讨“健脾”中药补剂对急性大强度运动大鼠线粒体功能的干预作用，以期能有效提高运动员技能水平，延缓运动疲劳的发生。

1 对象与方法

1.1 实验材料与仪器

中药补剂选用北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂生产的补中益气丸，药物组成为:黄芪(蜜炙)、党参、白术(炒)、柴胡、当归、升麻、陈皮和甘草(蜜炙)，药品批号为国药准字:Z11020244。线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性浓度检测试剂盒(ELISA)购于广州有田生物科技有限公司(RB分装)。大鼠跑台，恒温水浴振荡器，酶标仪(Biorad)。

1.2 动物与分组

SPF级SD大鼠27只，3月龄，180g－220g，适应性喂养1周，随机分成正常对照组、急性运动组，中药补剂组，每组雌鼠5只，雄鼠4只，各组动物体重无显著性差异。动物常规分笼饲养，室温控制在(23±3)℃，相对湿度40%－60%，自由进食、饮水。

1.3 实验方法

中药补剂组大鼠预先给予补中益气丸3g/Kg灌胃，每天一次，连续1周，其余大鼠给予等剂量蒸馏水进行平行对照。正式实验前两天，急性运动组和中药补剂组大鼠进行适应性跑台训练，速度为(5－10)m/min，使大鼠熟悉跑台。正式实验时进行大强度间歇性跑台运动，速度为27m/min，坡度为0°，总运动时间90min，每运动10min，间歇1min［5］。所有大鼠在实验结束后即刻处死，取股四头肌、肝脏样本，放入－80℃超低温冰箱迅速冷冻保存备用。采用双抗体夹心法酶联免疫分析(ELISA)测定大鼠肌肉和肝脏组织中线粒体呼吸链复合体活性浓度。

1.4 数据统计处理

实验数据均用mean±SD表示，组间用SPSS13.0软件进行单因素分析，P＜0.05，表示差异具有显著性。

2 结果

(1)急性运动组大鼠肌肉组织呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ活性高于正常对照组，而呼吸链复合体Ⅳ活性则低于正常对照组，但组间比较无统计学差异。中药补剂组大鼠肌肉组织呼吸链复合体Ⅰ、Ⅲ活性明显高于正常对照组(P ＜0.05)，见表1。

表1 大鼠肌肉组织呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性浓度的变化

(2)急性运动组与正常对照组的大鼠肝脏组织呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性浓度，组间差异均无统计学意义，而中药补剂能显著提高大鼠肝脏组织呼吸链复合体Ⅱ、Ⅲ的活性，与正常对照组比较，组间差异具有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2 大鼠肝脏组织呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性浓度的变化

3 讨论

机体在正常的生理状态下，线粒体氧化磷酸化供能提供了80%以上的能量，线粒体氧化磷酸化由线粒体内膜呼吸链(电子传递链)完成［3］。线粒体内膜呼吸链是位于线粒体内膜的一个酶体系，主要由复合体Ⅰ(NADH泛醌氧化还原酶)、Ⅱ(琥珀酸泛醌氧化还原酶)、Ⅲ(细胞色素c还原酶)、Ⅳ(细胞色素c氧化酶)、Ⅴ(ATP合成酶)及一系列辅酶组成，它们活性浓度的变化直接或间接地反映着线粒体的呼吸功能变化［6］。线粒体呼吸链的作用使需氧细胞内糖、脂肪、氨基酸等通过各自的分解途径，形成还原型辅酶，在复合体I或复合体Ⅱ的作用下，将其电子通过Q给复合体Ⅲ，再经细胞色素c传给复合体Ⅳ，最终还原氧生成水。在电子传递的同时，底物(NADH或琥珀酸)的氧化势能(△Eh)通过复合体I，复合体Ⅲ和复合体Ⅳ的质子泵作用转化为质子电化学梯度势能(△H)，后者再通过复合体V(H一ATP)转化为ATP的高级磷酸键能(△Gp)。在以Q为辅酶的电子传递过程中复合体I、Ⅱ和Ⅲ作用重大，如果它们的活性发生改变，必将影响电子传递过程，从而影响组织的能量代谢［7］。研究显示，呼吸链复合体是线粒体活性氧的主要来源部位［8］，呼吸链复合体对维持组织正常的功能起着重要作用。从能量代谢的角度看，线粒体内膜氧化磷酸化能力直接影响着机体的运动能力［9］。大量实验研究表明［10－14］不同运动方式或同种运动方式不同运动时间对大鼠线粒体呼吸链复合体有不同的影响:中长期有规律的有氧运动可有效提高大鼠线粒体呼吸链复合体活性，提高其骨骼肌的工作效率和运动持久能力，一次性无氧运动可以短时间提高上述酶活性，而长时间无氧运动则可能导致机体疲劳，造成对线粒体呼吸链复合体酶的损伤，影响骨骼肌工作效率。

本研究结果显示在急性大强度运动后即刻大鼠肌肉和肝脏组织的呼吸链复合体活性浓度普遍有轻微上升，但与正常对照组无显著性差异。急性运动过程中骨骼肌的收缩活动增加可导致线粒体功能代偿性提高，组织中参与氧化的物和终端氧化的酶含量及活性也会有所增长，以满足运动过程中的高能量需求，随着运动时间的延长，线粒体代偿功能会逐渐减弱。此研究结果与李洁等的报道［5，11，15］不尽完全统一，可能主要由于实验大鼠的月龄、鼠种、性别不同，造成大鼠对同一运动强度的耐受性不同。同时同一运动状态下，检测的组织不同及同一检测组织在不同的氧含量外环境下运动，也是结果差异出现的原因之一。这一现象的出现提示:大鼠组织线粒体功能对运动的耐受性有较大的个体差异，机体的能量代谢系统在运动过程中呈现出不同的阶段性表现;运动会引起线粒体呼吸链复合体的活性发生改变，这种变化在不同组织器官中的表现是不同的，可能在急性大强度运动过程中心肌组织和脑组织先于骨骼肌和肝脏出现疲劳征象，我们的同期实验中脑组织呼吸链的变化也证实这一推测;不同运动方式和时间对组织呼吸链复合体的影响也是不同的［12］，低氧训练会加大运动负荷对机体的刺激效应，诱导运动疲劳提前出现。急性运动过程中机体组织线粒体呼吸链复合体活性的变化规律及机制，有待通过进一步的相关实验加以证实。

中医学认为，脾的主要生理功能为主运化、主升举和主统血，其中以运化为核心。《素问集注.五脏生成》中说“脾主运化水谷之精，以生养肌肉.故主肉”。这说明脾胃为后天之本、气血生化之源，全身的肌肉都需要脾胃所运化的水谷精微来营养，肌肉才能发达丰满，臻于健壮。多数学者认为［16－17］脾主运化的生物学基础与线粒体的功能关系密切，线粒体的氧化磷酸化产能过程与脾主运化功能相吻合，提出了“脾——线粒体相关”的理论，故中医脾功能正常与否与细胞线粒体结构与功能的完整有着极密切的关系。研究发现［17－19］:脾虚大鼠、小鼠骨骼肌线粒体的形态、数量、功能均会发生异常改变，表现为:数目减少，肿胀、基质透明、嵴减少、呼吸链酶活性降低等，经过健脾方药和艾灸治疗［17，20］，上述线粒体的损伤均有所改善。可见，“健脾”可有效纠正细胞线粒体形态和功能的异常改变，促进损伤的恢复。补中益气丸由黄芪、党参、白术、柴胡、当归、升麻、陈皮和甘草8味药材组成，其具有补中益气，升阳举陷的功效，可用于治疗脾胃虚弱所致的体倦乏力，为“补脾”常药。补中益气丸当中的黄芪是主药，黄芪是一味具有益气健脾作用的中药，主要包括黄芪多糖、黄芪皂苷、黄芪黄酮类化合物等几十种有效化学成分，具有提高运动能力、延缓运动疲劳等作用，是一味常用的运动补剂。有研究显示［21－22］黄芪总苷能明显增强运动性疲劳大鼠骨骼肌抗氧化能力，减少其乳酸含量，黄芪总苷还能有效提高运动大鼠骨骼肌和脑组织的ATP酶活性。补中益气丸中其它7味中药也都具有补益脾胃之气的功效:党参能平补中焦脾胃之气，白术能够补气健脾，柴胡和升麻具有升阳举陷功效，多用于脾胃阳气下陷的病症，当归能补血活血，归心、脾经，陈皮具有理气健脾，燥湿化痰之功效，甘草可起到清热解毒、补中益气的作用。本研究以大鼠一次性大强度急性运动为模型，观察“补中益气丸”对急性大强度运动大鼠肌肉、肝脏线粒体电子传递链酶复合体(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)活性浓度的影响，为健脾中药在对抗运动性疲劳领域中的应用提供客观评价依据。

本实验结果显示，中药补剂组大鼠的肌肉组织的呼吸链复合体Ⅰ、Ⅲ及肝脏组织的呼吸链复合体Ⅱ、Ⅲ活性明显高于正常对照组，由此说明补充“健脾”中药在维护骨骼肌和肝脏线粒体呼吸链复合体活性的作用明显，补中益气丸通过维持机体组织线粒体呼吸链酶活性，保持呼吸链的完整性，改善了线粒体氧化磷酸化功能，以满足急性运动中能量增加的需求。研究结果提示补充“健脾”中药能通过调节呼吸链复合体活性浓度，提高线粒体氧利用能力，改善急性大强度运动大鼠能量代谢，呼吸链复合体活性的增加有利于运动中细胞稳态的维持，可提高其组织的工作效率和运动持久能力，对运动疲劳具有较好的干预效果，有利于运动成绩的提高。

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