花生肽的体外抗氧化活性研究

彭维兵，陈维云，王雪，陈锡强，刘可春

(山东省科学院生物研究所，山东省生物传感器重点实验室，山东 济南 250014)

现代科学研究表明，自由基在人体的衰老和肿瘤的发病过程中起着非常重要的作用，尤其是羟自由基和超氧阴离子与心血管疾病、癌症、高血压、炎症的休克等都有密切的关系［1－4］。机体抗氧化酶的活性降低和过多自由基的生成，致使人体内积蓄了大量的氧自由基，活性氧自由基的平衡被打破，从而过量地损伤细胞，进而危害人类的健康。因此，研究并开发高效低毒性的、能够保护人类机体免受过量自由基损害的药物或者保健品，成为人们关注的热点［5－8］。

目前，抗氧化剂大多为合成的物质，纯天然的物质并不多见。本课题组从纯天然食品花生中提取、分离得到了分子量在1 kD以下的花生肽，并对花生肽的作用，如对小鼠的抗运动性疲劳作用、四氯化碳致小鼠肝损伤的保护作用及对原发性高血压大鼠的降压作用进行过较为系统的实验研究，证实了其在上述各方面的药理活性［9－11］。本文将继续探讨花生肽的体外抗氧化活性，为其广泛应用提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 药物与试剂

花生肽样品:实验室自制，分子量在1 kD以下;Tris-Hcl，硫代巴比妥酸(TBA)，1，1-二苯基-2-三硝苯肼(DPPH)，三氯乙酸(TCA)，butylated hydroxytoluene(BHT)均购于Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA);硫酸亚铁，无水乙醇，过氧化氢等试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器

Anke TGL-16C/Anke TDL-5离心机，上海安亭科学仪器厂;BIO-TEK全自动酶标仪，美国。

2 实验方法

2.1 DPPH自由基的清除能力的测定［12］

准确称取DPPH样品4 mg，用无水乙醇溶解并定容于100mL容量瓶中，得到浓度为0.04 mg/mL的DPPH 母液，于0 ～4℃避光保存。将花生肽样品配成浓度分别为 0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mg/mL 的样品溶液，并将浓度为0.04 mg/mL的DPPH溶液4 mL与上述溶液各1 mL分别加入试管混合，充分摇匀，在暗室中放置30min后，以无水乙醇作为空白对照，以BHT作为阳性对照，在517 nm下用酶标仪测定吸光度值A，并用下列公式计算清除率，清除率数值越大表示其抗氧化能力越强。

清除率=［(A0–A1)/A0］×100%，

其中:A0为4.0mL DPPH溶液和1 mL无水乙醇的吸光度值;A1为4.0mL DPPH溶液和待测溶液的吸光度值。

2.2 还原力的测定［13］

分别取 1.0mL 浓度为0.1、0.2、0.4、0.8、1 mg/mL 的花生肽被测溶液加入试管中，再加入 2.5 mL 浓度为0.01 mg/mL的铁氰化钾和2.5 mL pH值为6.6、浓度为0.2 mol/L的磷酸盐缓冲溶液，均匀混合，放置于50℃的电热恒温水浴锅中反应20min，然后加入2.5 mL浓度为0.1 mg/mL的三氯乙酸，充分摇匀，并3500 r/min离心10min。吸取2.5 mL上清液，加入浓度为0.01 mg/mL的三氯化铁溶液0.5 mL和蒸馏水2.5 mL。在700 nm波长下测定样品吸光度值。

2.3 抗脂质过氧化能力的测定［14－15］

首先配制pH值为7.45浓度为0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)，用其按照1:25的比例配制成卵黄悬液。在试管中分别加入浓度为0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 和6.4 mg/mL 的被测溶液 1.0mL，再加入浓度为25 mmol/L的硫酸亚铁0.4 mL和0.4 mL卵黄悬液，最后用pH值为7.45浓度为0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液补充至4 mL，在37℃气浴恒温振荡器中振荡15 min后，加入浓度为20mg/mL的三氯乙酸(TCA)1.0mL，静置10min，并3500 r/min离心10min，吸取上清液4 mL，加入浓度为0.8mg/mL的TBA 2 mL，于沸水浴中15 min，冷却，以6 mL PBS为空白管调零，以BHT作为阳性对照，在532 nm下用酶标仪测定吸光度值，用对卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制率表示样品的抗氧化活性，用下列公式计算:

抑制率I%=(A0－A)/A0×100%，

其中，不加样品管的吸光度为A0，样品管的吸光度为A，

2.4 统计学方法

3 实验结果

3.1 花生肽对DPPH自由基的清除能力

由图1可知，在0.1～3.2 mg/mL浓度范围内，维生素C对DPPH自由基的清除率基本保持不变，其清除率在92.4%左右。花生肽对DPPH自由基的清除率随浓度增加逐渐上升，当浓度达到3.2 mg/mL时，花生肽对DPPH自由基的清除率为78.7%，但低于维生素C。

3.2 花生肽的还原能力

从图2可知，在0.1～1 mg/mL浓度范围内，随着花生肽浓度的增加，其还原能力增强。维生素C在0～0.2 mg/mL浓度范围内，还原能力逐渐增强，在浓度为0.2 mg/mL时，还原能力达到2.8。花生肽样品浓度在1 mg/mL时，还原能力达到1.7。表明花生肽样品具有一定的还原能力，但还原能力不如维生素C强。

图1 花生肽在不同浓度下清除DPPH自由基能力分析Fig.1 Analysis of DPPH free radical scavenging capability of peanut peptides under different concentrations

图2 花生肽在不同浓度下的还原能力分析Fig.2 Reducing capability analysis of peanut peptides under different concentrations

3.3 花生肽抗脂质过氧化能力的测定

图3表明，在0.2～6.4 mg/mL浓度范围内，维生素C对卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制率基本保持不变，其抑制率在95%左右。花生肽对卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制率随浓度增加逐渐上升，当浓度达到6.4 mg/mL时，花生蛋白肽对卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制率为78.6%。

图3 花生肽在不同浓度下抗脂质过氧化能力分析Fig.3 Analysis ofanti-lipid peroxidation capability of peanut peptides under different concentrations

4 结论

花生肽作为纯天然的保健食品，在人们的生活中已经得到广泛应用，但是对分子量在1 kD以下的花生肽的相关研究较少。本文对花生肽的体外抗氧化作用进行了初步探讨，证实了花生肽对DPPH自由基具有较好的清除能力和一定的还原能力，并对卵黄脂蛋白脂质过氧化具有较好的抑制作用，具有进一步开发成为保健食品的可行性。

在以前的研究中，作者也验证了花生肽的抗疲劳、治疗肝损伤和降血压的作用。这些较为系统的研究，为花生肽开发成为具有多种功效的保健食品提供了理论依据。

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