流式细胞术和血栓弹力图检测对冠心病经皮冠状动脉介入术后氯吡格雷的反应性评估

赵 燕，杨 明，金 新，马 杰，崔建英，贾 晓，高 亢，孙一光

氯吡格雷联合阿司匹林双重抗血小板治疗是目前急性冠脉综合征和冠心病患者经皮冠状动脉介入术(PCI)后的常规治疗方案。但部分患者即使接受常规抗血小板治疗，临床上仍不能有效防止血栓事件的发生，且不能有效抑制血小板聚集。其主要原因与氯吡格雷低反应性有关。如何监测血小板功能，进行有效的危险分层和预后评估，进而实行抗血小板药物的个体化治疗已成为临床亟待解决的问题。流式细胞术是目前常用且较稳定的实验室血小板功能检测方法，PAC-1 和CD62p是主要的血小板受体活化标志物。CD62p的增加并不会随着时间的延长而发生逆转,因此其被认为是血小板功能检测的“金标准”[1]。流式细胞术灵敏度、特异度、准确度均较高,但是费用昂贵、操作复杂，临床适用性不高。血栓弹力图(TEG)是一种从凝血、血小板聚集、纤溶等方面动态监测凝血全过程的床旁快速血小板功能检测方法。随着临床TEG在抗血小板聚集药物疗效监测中的应用，其对缺血事件的预测价值已得到证实，临床上常以二磷酸腺苷(ADP)抑制率评估氯吡格雷的反应性。本研究以流式细胞术为参考标准评估血小板功能，同时应用TEG检测的ADP抑制率评估氯吡格雷抗血小板聚集的治疗效果，经过1年的临床随访，探讨流式细胞术和TEG检测对氯吡格雷反应性的评估价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象 入选2011年2—12月首都医科大学附属复兴医院心内科收治住院，诊断为冠心病并行PCI，且术后行常规抗血小板治疗并同意参与本研究的患者89例作为观察组，其中男54例，女35例；年龄(67.8±11.2)岁。同时选取该院同期体检健康者29例作为对照组，其中男16例，女13例；年龄(48.3±6.6)岁。排除标准：既往有出血病史者；正在使用华法林或肝素抗凝治疗者；正在服用非甾体类抗炎药物者；肝功能不全〔门冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT) 检测>参考值(40 U/L)2倍以上〕者；肾功能不全(肌酐>140 μmol/L)者；患风湿性疾病者；血小板计数<80×109/L或>450×109/L者；肿瘤或血液系统疾病者。两组的性别构成、年龄比较，差异无统计学意义(χ2= 0.754,t=0.421，P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 实验室检查 患者入院即刻抽取肘静脉血查白细胞计数(WBC)、血小板计数(PLT)、血红蛋白(Hb)、血糖(GLU)、血钾(K)、血钠(Na)、血氯(Cl)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、血尿酸(UA)、血脑利钠肽(BNP)、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(Fgb)，记录并录入数据库。

1.2.2 治疗方法 观察组患者在术后坚持服用冠心病二级预防药物，抗血小板药物联合应用阿司匹林100 mg (1次/d)和氯吡格雷75 mg(1次/d)。

1.2.3 CD62p及PAC-1的检测 患者均在行冠状动脉造影PCI后第7天晨起空腹抽取肘静脉血5 ml置于109 mmol/L枸橼酸钠抗凝真空管(美国BD公司)中，并取5 μl血分别加入事先置有单抗(美国BD公司产)的塑料管内，其中对照管含CD61Per-CP、鼠抗人IgM-FITC、鼠抗人IgG 1-PE各20 μl，实验管含CD61Per-CP、鼠抗人IgM-FITC、鼠抗人IgG 1-PE、CD62-PE各20 μl。两管均室温避光反应20 min，每管分别加入1 ml含1%多聚甲醛的PCS固定20 min，置于4 ℃冰箱保存，并于24 h内应用流式细胞仪(美国Becton Dickin公司)检测血小板膜糖蛋白CD62p及PAC-1的表达率〔CD62p(GMP·140)、PAC-1检测均用5 μmol/L二磷酸腺苷诱导〕。对照组晨起抽取肘静脉血5 ml 置于109 mmol/L 枸橼酸钠抗凝真空管(美国BD公司)，2 h内应用流式细胞仪(美国Becton Dickin 公司)检测血小板膜糖蛋白CD62p及PAC-1的表达率。

1.2.3 ADP抑制率的检测 用含109 mmol/L的枸橼酸钠0.4 ml抗凝的真空采血管和肝素钠真空采血管分别采血2.7 m1和3.0 ml，3 h内应用TEG@5000(美国Haemoscope公司产)检测ADP抑制率。试剂包括：花生四烯酸(AA)、ADP、激活剂F(由蝮蛇血凝酶和血小板XⅢa因子混合而成)、高岭土(含1%kaolin液)。

1.2.4 出血分级标准 依据血流分级(TIMI)出血评分标准[2]进行分级，主要出血：颅内出血或临床可见的出血(包括影像学)，伴Hb水平下降>50 g/L；小出血：临床可见的出血(包括影像学)，伴Hb水平下降30～50 g/L；轻微出血：临床可见的出血(包括影像学)，伴Hb水平下降<30 g/L。

1.3 观察指标 流式细胞术检测血小板活化标志物PAC-1 和CD62p受体表达量，TEG检测反映氯吡格雷效果的ADP抑制率，同时随访患者1年内缺血事件和出血事件发生率。

2 结果

2.1 观察组患者临床资料 观察组患者临床资料详见表1。

表1 患者临床资料(n=89)Table 1 The clinical data of patients

2.2 氯吡格雷反应性判断标准 根据统计学四分位数间距法,计算出血小板活化标记物表达量,定义血小板活化标记物CD62p>15.5%同时PAC-1>3.01%为血小板活化程度高表达，代表氯吡格雷反应性较低；血小板活化标记物CD62p>15.5%或者PAC-1>3.01%为血小板活化程度中等表达；血小板活化标记物CD62p<15.5%或者PAC-1<3.01%为血小板活化程度低表达，代表氯吡格雷反应性较好。

2.3 ADP抑制率与CD62p、PAC-1表达率拟合度 以流式细胞术检测的CD62p、PAC-1反应血小板功能，参考国外Godino等[3]研究中采用统计学四分位数间距法定义，两者表达率均明显增高(以CD62p>15.5%和PAC-1>3.01%定义为氯吡格雷反应性低即血小板高反应性)，评估TEG检测方法，当ADP抑制率为38.9%时灵敏度为97.0%、特异度为61.1%，ROC曲线下的面积为0.932(P=0.001，见图1)。

图1 ADP抑制率诊断氯吡格雷低反应性的ROC曲线Figure 1 ROC curve of ADP inhibition rate for diagnosis of clopidogrel low reactivity

2.4 PAC-1表达率与ADP抑制率的比较 血小板活化程度高表达患者有46例，中等表达患者43例，无低表达患者(见图2)。结合ADP抑制率<38.9%，40例患者氯吡格雷反应性较低。

图2 PAC-1表达率与ADP抑制率的比较Figure 2 Comparison of the expression inhibition rate of PAC-1 and ADP

2.5 CD62p表达率与ADP抑制率的比较 血小板活化标记物CD62p>15.5%同时PAC-1>3.01%的血小板活化程度高表达患者46例，中等表达患者43例，无低表达患者(见图3)。结合ADP抑制率<38.9%，40例患者氯吡格雷反应性较低。

2.6 患者随访结果 反应性较低的患者与反应性中等的患者缺血事件发生率和出血事件发生率比较，差异均无统计学意义(P>0.05，见表2)。所有随访患者仅4例发生轻微出血，主要表现为局部皮下出血、牙龈出血和眼底出血。

图3 CD62p表达率与ADP抑制率的比较Figure 3 Comparison of the expression inhibition rate of CD62p and ADP

3 讨论

阿司匹林和氯吡格雷双重抗血小板治疗是目前接受PCI和/或急性冠脉综合征患者的标准治疗[4]。然而，尽管在PCI后服用阿司匹林和氯吡格雷，1.0%～1.9%患者仍可能会发生急性或亚急性支架内血栓形成[5]。有研究认为，氯吡格雷的低反应患者发生心血管事件的风险增加了20%[6-7]。此外，有数据表明，支架置入后1个月内的氯吡格雷低反应性可以预测不良心血管事件[8]。冠心病患者行PCI后需长期服用抗血小板药物，但服用双联抗血小板药物仍然有患者发生心脑血管再次缺血[9]，还有患者在服用药物期间因各种原因发生出血并发症。因此，在临床环境中探索患者对服用抗血小板药物的反应是目前全世界心血管临床医生共同面临的难题[10]。

本研究通过检测行PCI患者术后1周服用双联抗血小板药物血小板活化标记物的表达率及血小板ADP抑制率，以探索TEG检测氯吡格雷的反应性，并寻找能在临床应用中相对准确地反映患者血小板功能状态的实验室检查方法及判定范围。

本研究连续观察了89例同意参加本试验并行PCI的冠心病患者89例，年龄67～79岁，为高龄患者；其中糖尿病患者39例(43.8%)，血管病变为三支或左主干+三支病变53例(59.6%)，行3枚及以上支架24例(26.9%)。本研究发现，按照血小板活化标记物CD62p、PAC-1用统计学四分位数间距法界定的氯吡格雷反应性较低患者有40例(44.9%)，与目前文献报道的氯吡格雷低反应性发生率波动在5%～44%相近[11]，可能与本研究连续入选的为高龄患者，且复杂病变、多支病变发生率>50%，糖尿病患者的比例较高有关[12]。经过1年的临床随访观察，氯吡格雷反应性较低的40例患者中有1例行PCI后1年内行冠状动脉旁路移植术，同时有1例患者死亡,3例因严重心脏缺血致心律失常、心绞痛等再入院；与氯吡格雷反应中等的49例患者相比，前者在缺血事件上相对增多,但两组缺血事件发生率无明显差异，可能与本研究样本数量较少有关。此外，氯吡格雷反应性较低患者较氯吡格雷反应性中等患者的轻微出血率低，但两组无明显差异。以上结果提示，对高龄、高危冠心病患者进行TEG监测有一定临床意义，但因本研究样本量较少，结果可能存在偏倚，提示今后可继续扩大样本量进行深入研究。

本研究通过TEG检测患者ADP抑制率[13]，反映患者对氯吡格雷的反应性。结果显示，当ADP抑制率为38.9%时，灵敏度为97.0%、特异度为61.1%、ROC曲线下面积为0.932。临床检验科提示TEG检测的ADP抑制率>50%为药物反应良好,如果<20%说明血小板对药物反应性差，因此本研究以ADP抑制率<38.9%可以较准确地反映患者对氯吡格雷的反应性较低，若按照<20%界定就可能漏掉一些高危患者，所以继续扩大样本延长随访时间有助于更准确地反映患者对抗血小板药物的反应性。本研究通过流式细胞术检测血小板活化标记物CD62p、PAC-1表达率与TEG检测ADP抑制率的比较显示，血小板活化标记物CD62p>15.5%同时PAC-1>3.01%的血小板活化程度高表达患者46例，中等表达患者43例，无低表达患者。结合ADP抑制率<38.9%，40例患者氯吡格雷反应性较低。因此，与较昂贵且繁琐的流式细胞术相比，临床应用TEG检测可以监测对氯吡格雷反应性较低的患者，进而降低心脑血管事件(死亡、非致命性心肌梗死、再次血运重建、脑卒中)发生率。

表2 患者1年缺血事件和出血事件的随访结果〔n(%)〕Table 2 Follow up of the patients with 1 years of ischemic events and bleeding events

PCI后再狭窄是困扰医师与患者的主要问题，强化抗血小板治疗并不能对每位患者起到良好效果。日本、韩国的几项临床研究提示，氯吡格雷无反应性或反应性低下的发生率为4%～40%[14-15]。目前临床研究提示，加大首次负荷剂量甚至给予两次负荷剂量可以提高氯吡格雷的抗血小板作用[16]。也有研究认为，合用替罗非班可以降低选择性PCI后的心肌梗死发生率[17]。对氯吡格雷反应性差异的研究仍在探索中，全世界心血管医生正努力寻找解决方案。有研究提示，新型抗血小板药物替格瑞洛可能是解决对氯吡格雷反应性低下患者的另一类机制药物，但仍需要临床研究证实。

综上所述，TEG检测冠心病患者行PCI后对氯吡格雷低反应性的ADP抑制率<38.9%，提示患者对药物可能存在抵抗，在临床工作中需关注这部分患者，以降低患者心脑血管事件的发生率。

1 Patti G,Colonna G,Pasceri V,et al.Randomized trial of high loading dose of clopidogrel for reduction of periprocedural myocardial infarction in patients undergoing coronary intervention:results from the ARMYDA-2(Antiplatelet therapy for Reduction of MYocardial Damage during Angioplasty)study[J].Circulation，2005,111(16):2099-2106.

2 Morrow DA,Scirica BM,Karwatowska-Prokopczuk E,et al.Effects of ranolazine on recurrent cardiovascular events in patients with non-ST-elevation acute coronary syndromes:the MERLIN-TIMI 36 randomized trial[J].JAMA,2007,297(16):1775-1783.

3 Godino C,Mendolicchio L,Figini F,et al.Comparison of VerifyNow-P2Y12 test and Flow Cytometry for monitoring individual platelet response to clopidogrel.What is the cut-off value for identifying patients who are low responders to clopidogrel therapy?[J].Thrombosis Journal,2009,7:4.doi:10.1186/1477-9560-7-4.

4 Bertrand ME,Rupprecht HJ,Urban P,et al.Double-blind study of the safety of clopidogrel with and without a loading dose in combination with aspirin compared with ticlopidine in combination with aspirin after coronary stenting:the clopidogrel aspirin stent international cooperative study(CLASSICS)[J].Circulation，2000，102(6):624-629.

5 Airoldi F,Colombo A,Morici N,et al.Incidence and predictors of drug-eluting stent thrombosis during and after discontinuation of thienopyridine treatment[J].Circulation，2007,116(7):745-754.

6 Lev EI,Patel RT,Maresh KJ,et al.Aspirin and clopidogrel drug response in patients undergoing percutaneous coronary intervention the role of dual drug resistance[J].J Am Coll Cardiol，2006,47(1):27-33.

7 Matetzky S,Shenkman B,Guetta V,et al.Clopidogrel resistance is associated with increased risk of recurrent atherothrombotic events in patients with acute myocardial infarction[J].Circulation，2004,109(25):3171-3175.

8 Campo G,Parrinello G,Ferraresi P,et al.Prospective evaluation of on-clopidogrel platelet reactivity over time in patients treated with percutaneous coronary intervention relationship with gene polymorphisms and clinical outcome[J].J Am Coll Cardiol，2011，57(25):2474-2483.

9 Bliden KP,DiChiara J,Tantry US,et al.Increased risk in patients with high platelet aggregation receiving chronic clopidogrel therapy undergoing percutaneous coronary intervention:is the current antiplatelet therapy adequate?[J].J Am Coll Cardiol，2007，49(6):657-666.

10 Gurbel PA,Bliden KP,Butler K,et al.Response to ticagrelor in clopidogrel nonresponders and responders and effect of switching therapies:the RESPOND study[J].Circulation,2010，121(10):1188-1199.

11 Breet NJ,van Werkum JW,Bouman HJ,et al.Comparison of platelet function tests in predicting clinical outcome in patients undergoing coronary stent implantation[J].JAMA，2010，303(8):754-762.

12 Marcucci R,Gori AM,Paniccia R,et al.Cardiovascular death and nonfatal myocardial infarction in acute coronary syndrome patients receiving coronary stenting are predicted by residual platelet reactivity to ADP detected by a point-of-care assay:a 12-month follow-up[J].Circulation，2009，119(2)：237-242.

13 Bonello L,Tantry US,Marcucci R,et al.Consensus and future directions on the definition of high on-treatment platelet reactivity to adenosine diphosphate[J].J Am Coll Cardiol，2010，56(12):919-933.

14 Hoshino K,Horiuchi H,Tada T,et al.Clopidogrel resistance in Japanese patients scheduled for percutaneous coronary intervention[J].Circ J,2009,73(2):336-342.

15 Shim CY,Yoon SJ,Park S,et al.The Clopidogrel resistance can be attenuated with triple antiplatelet therapy in patients undergoing drug-eluting stents implantation[J].Int J Cardiol,2009,134(3):351-355.

16 Di Sciascio G,Patti G,Pasceri V.et al.Clopidogrel reloading in patients undergoing percutaneous coronary intervention on chronic clopidogrel therapy results of the ARMYDA-4 RELOAD randomized trial[J].Eur Heart J,2010,31(11):1337-1343.

17 Maioli M,Bellandi F,Leoncini M,et al.Randomized early versus late absiximab in acute myocardiol infarction treated with primary coronary intervention(RELAX-AMZ Trial)[J].J AM Coll Cardiol,2007,49(14):1517-1524.