荧光衍生法测定中药二氧化硫残留量研究

彭月，李雪莲，银玲，陈鸿平，樊丹青，刘友平

[摘要] 目的：采用衍生化反应，建立荧光分光光度法测定中药中二氧化硫的残留量。方法：对影响荧光强度的因素进行研究，确定最佳衍生条件。在激发波长321 nm，发射波长384 nm处测定荧光强度。结果：荧光强度与Na₂SO₃对照品加入量在0.999 7～17.99 nmol线性关系良好，r=0.999 9，平均回收率102.3%，RSD 4.6%。结论：该法具有简便易行，快速准确，灵敏度高等特点，可为中药材二氧化硫残留量的测定提供参考。

[关键词] 荧光分光光度法；衍生；二氧化硫残留量；中药

硫磺是一种古老的用于中药防虫的药物，不少中药材产地加工时都会硫熏，利用硫磺加热产生的二氧化硫达到漂白药材及杀菌防霉防虫的目的，由于硫磺熏蒸后中药材的性状及化学成分多有改变，且熏蒸后的中药材中残留的二氧化硫对人体有很大伤害[1]，《中国药典》2005年版取消了药材的“硫磺熏蒸养护法”， 并在《中国药典》2010年版附录中增加了基于蒸馏法的二氧化硫残留量测定法，由于该法要求专门的全玻璃蒸馏仪器，推广很慢，其他测定中药二氧化硫残留量的方法尚有盐酸副玫瑰苯胺法[2]、高效液相色谱法[3]、气相色谱法[4]和离子色谱法[5]等，但盐酸副玫瑰苯胺法操作过程中需使用有毒的四氯汞钠溶液，几种色谱法需要相应的设备及填充柱等，检测成本较高。

本研究根据亚硫酸钠-邻苯二甲醛-铵盐在中性或弱酸性条件下反应生成具有强烈荧光的化合物1-磺酸基-异吲哚，首次建立了荧光衍生法用于中药材二氧化硫残留量测定的方法，具有灵敏度高，选择性好，分析速度较快等优点，以期为中药材二氧化硫残留量的测定提供一种新的参考方法。

1 材料

RF-5301（PC）S荧光分光光度计（日本岛津公司）；电子分析天平BP211D（1/10 万，德国Sartorius公司），电子分析天平BP121S（1/1 万，德国Sartorius公司）；pHS-3C型酸度计（上海雷磁仪器厂）；WHY-2水浴恒温振荡器（江苏金坛市金城国胜实验仪器厂）；恒温水浴锅W201B（北京国华医疗器械厂）。

亚硫酸钠对照品（美国Fisher公司，批号120224，纯度99.5%）；其他试剂均为分析纯，实验用水为重蒸馏水；中药材样品购于荷花池中药材市场，均经成都中医药大学卢先明教授鉴定。

2 方法

2.1 试剂配制

亚硫酸钠对照品储备液：精密称取亚硫酸钠对照品适量，加水溶解制成1 mmol·L^-1亚硫酸钠对照品储备液，避光冷藏，使用时用水稀释至所需浓度。

邻苯二甲醛溶液：准确称取0.134 1 g邻苯二甲醛，无水乙醇溶解后定容至100 mL棕色量瓶中作为储备液，避光冷藏，使用时移取10.0 mL定容至100 mL配成1 mmol·L^-1的邻苯二甲醛工作液。

乙酸铵溶液：准确称取7.708 0 g乙酸铵（AR），用水溶解后定容至1 000 mL棕色量瓶中作为储备液，避光冷藏，使用时移取5.0 mL定容至100 mL配成5 mmol·L^-1乙酸铵工作液。

磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液：将浓度为0.3 mol·L^-1的磷酸氢二钠和磷酸二氢钾溶液按照不同体积比混合，配成一系列不同pH的缓冲溶液。

2.2 荧光衍生法测定

准确移取2.0 mL 磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液（pH 6.44），适量样品溶液于10 mL量瓶中，依次加入1 mmol·L^-1邻苯二甲醛溶液2.5 mL及5 mmol·L^-1乙酸铵溶液1.5 mL，混匀，用水定容，于50 ℃水浴中恒温5 min，取出，立即放入冰水中冷却，终止反应，静置40 min，以试剂空白为参比，于1 cm的石英比色皿中测定激发波长为321 nm，发射波长为384 nm时样品的相对荧光强度。

3 结果

3.1 激发光谱和发射光谱

按实验方法配制溶液，然后在荧光分光光度计上分别扫描其激发光谱和发射光谱，见图1，可知体系的最佳激发波长为321 nm，发射波长为384 nm。

3.2 试验条件的选择

3.2.1 缓冲液pH及其用量的影响 试验考察了不同pH 磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液对体系荧光强度的影响，见图2，发现pH在6.37 ～ 6.47，衍生物的相对荧光强度大且稳定。当pH为6.44，产物的相对荧光强度最大，故选择pH 6.44的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液作为测定的酸度条件，其加入量2.0 mL较为适宜。

3.2.2 邻苯二甲醛用量的影响 取适量的亚硫酸钠分别加入不同体积的1 mmol·L^-1邻苯二甲醛溶液，经衍生后测定产物的相对荧光强度，见图3，表明随着邻苯二甲醛溶液用量的增大，产物的荧光强度先增大后降低，当其用量为2.5 mL时，荧光强度最大，继续增加用量产物荧光强度反而降低，故本实验选择加入1 mmol·L^-1邻苯二甲醛溶液2.5 mL。

3.2.3 乙酸铵浓度及用量的影响 试验考察了不同浓度乙酸铵对衍生物荧光强度的影响，见图4，随着乙酸铵浓度的增大，衍生物的荧光强度先增大后降低，当乙酸铵浓度为5 mmol·L^-1时，荧光强度达到最大，故本实验选择5 mmol·L^-1乙酸铵溶液，其加入量1.5 mL较为适宜。

3.2.4 反应温度和反应时间的影响 按实验方法，分别在不同温度和反应时间下进行衍生反应，然后测定产物的相对荧光强度，见图5，表明50 ℃水浴中反应5 min最佳，然后立即冰水浴冷却，终止反应。

3.2.5 静置时间的影响 按实验方法对对照品试样衍生化处理后，静置一定时间后测定其相对荧光强度，见图6，随静置时间延长产物相对荧光强度有所降低，当静置在30～50 min衍生物相对荧光强度趋于稳定，故本实验选择反应完成后静置40 min测定产物的相对荧光强度。

3.3 供试品溶液的制备

取中药细粉约1 g，精密称定，精密加入0.5%氢氧化钠溶液25 mL，摇匀，振荡提取（200 r·min^-1，40 ℃） 30 min，滤过，取1.0 mL稀释至25 mL，即得。

3.4 方法学验证

3.4.1 线性关系试验 分别精密吸取对照品储备液0.1，0.3，0.7，1.2，1.5，1.8 mL用水稀释至100 mL，然后再分别移取上述不同浓度的稀释液1.0 mL，按实验方法测定产物的相对荧光强度。以荧光强度为纵坐标，亚硫酸钠对照品的加入量（nmol）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=46.247 X-15.007， r²=0.999 8，表明亚硫酸钠加入量在0.999 7～ 17.99 nmol线性关系良好。

3.4.2 精密度试验 取同一批山药样品，按3.3项下方法，制备供试品溶液，平行测定6次，记录荧光强度，计算RSD 1.6%，表明仪器精密度良好。

3.4.3 稳定性试验 取已制备好的同一份样品溶液，测定前避光冷藏，按上述实验方法分别在0，0.5，1，1.5，2，2.5 h测定，记录荧光强度，结果2 h内样品荧光强度的RSD 2.8%，表明样品溶液在避光冷藏的条件下2 h内稳定。

3.4.4 重复性试验 取同批次山药样品，按供试品溶液制备方法平行制备6份供试品溶液，按上述实验方法测定其荧光强度，结果样品中二氧化硫质量分数平均为 411.4 μg·g-1，RSD 1.9%，表明该方法重复性良好。

3.4.5 加样回收试验 取已知二氧化硫含量的同批次山药样品6份，约0.5 g，精密称定，精密加入亚硫酸钠对照品溶液适量，按供试品溶液的制备与测定同法操作，测定荧光强度，计算二氧化硫含量与回收率，得平均回收率为102.3%，RSD 4.6%，见表1。

3.4.6 样品测定 按照建立的方法测定所购买部分中药材的二氧化硫含量，见表2。

4 讨论

基于亚硫酸钠-邻苯二甲醛-铵盐在中性或弱酸性条件下反应生成具有强烈荧光的化合物1-磺酸基-异吲哚的原理，本研究建立了一种测定中药中二氧化硫含量的新方法。较之《中国药典》2010年版附录规定的标准方法需特制的全玻璃蒸馏装置，测定过程中人为、偶然误差较大，该荧光衍生法操作过程可控，人为误差小。本方法具有简便、快速、灵敏度和准确度高等特点，对常见离子进行荧光光谱的干扰实验结果表明，当亚硫酸钠的加入量为12.00 nmol，相对误差在5%内时，100倍的Na⁺，K⁺，NH₄⁺，Cl^-，HCO₃^-，NO₂^-，SCN^-，H₂PO₄^-，HPO₄^2-，S^2-，SO₄^2-，CO₃^2-等的存在对测定无干扰。利用该法对山药、葛根、枸杞和麦冬的测定与2010年版《中国药典》方法结果较一致，对于方法的测定结果可靠性的验证有待进一步研究。

中药硫熏过程中，单质硫经加热氧化成二氧化硫，与中药里的无机元素生成亚硫酸盐，以游离态、可逆结合态和不可逆结合态3种形式存在。本研究采用碱性溶液提取样品，可将其中可逆结合态的亚硫酸盐释放出来，并对振荡提取法提取过程中的某些影响因素进行研究，结果确定的提取时间比标准方法大大缩短，利用此方法对山药、葛根、枸杞和麦冬进行一次提取，与2010年版《中国药典》规定方法比较各药提取率均在90%以上，表明振荡提取法可作为一种样品前处理方法用于中药二氧化硫残留量的测定。该法采用仪器提取的方式，自动化程度较高，适用于大批量样品的提取。

本研究应用建立的荧光衍生法对部分中药材中的二氧化硫含量进行测定，与中药材中二氧化硫残留量检测限度征求意见稿规定的限量进行比较，购买的药材中二氧化硫残留量均不符合要求，提示目前中药硫熏的现象仍然存在，对中药材硫熏的替代加工技术有待深入研究。

[参考文献]

[1] 刘东奇，陈华成，杨雪丽. 二氧化硫对机体各组织器官毒性作用的研究进展[J]. 兽牧兽医杂志，2008，27（1）：37.

[2] 中国国家标准管理委员会. 食品卫生检验方法理化部分（一）[S]. GB/T5009.34-2003： 267-273.

[3] Stephen Wai Cheung Chung， Benny T P Chan， Andy C M Chan. Determination of free and reversibly-bound sulfite in selected foods by high-performance liquid chromatography with fluorometric detection[J]. J AOAC Int，2008，91：98.

[4] 孙艳平，李涛. 顶空气相色谱火焰光度检测器检测山药中的二氧化硫[J]. 山西医学杂志， 2010，39（8）：1024.

[5] 王欣美，夏晶，王柯，等. 碱性溶液提取-离子色谱法测定中药中二氧化硫残留量[J]. 中国中药杂志，2011，36（19）：2656.

Determination of sulfur dioxide in traditional Chinese

medicine by derivative fluorometry

PENG Yue， LI Xue-lian， YIN Ling， CHEN Hong-ping， FAN Dan-qing， LIU You-ping*

（Laboratory Constructed by PRC and Sichuan Province in Systematically Research and Development

Utilization of Traditional Chinese Medicine Resources， Department of Pharmacy， Chengdu

University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， China）

[Abstract] Objective： To establish a derivative fluorometry method for the determination of sulfur dioxide residues in traditional Chinese medicine. Method： The optimal derivation condition was established. The fluorescence intensity was detected at excitation wavelength of 321 nm， and emission wavelength of 384 nm. Result： A linear relationship was obtained between the fluorescence intensity and the addition of reference substance in the range of 0.999 7-17.99 nmol with a correlation coeffient of 0.999 9， and the average recovery was 102.3% with RSD 4.6%. Conclusion： This method is simple and sensitive with quick and correct result. It can provide a reference for the determination of sulfur dioxide residues in traditional Chinese medicine.

[Key words] fluorescence spectrophotometry； derivative； sulfur dioxide residues； traditional Chinese medicine

doi：10.4268/cjcmm20130214

[责任编辑 孔晶晶]