HPLC—DAD同时测定柘树和构棘根与茎中4种黄酮类成分的含量

李波,王美,谭亚南,佟苗苗,翟延君

[摘要] 目的：分析比较柘树与构棘根及茎中花旗松素、柑桔素、槲皮素、山柰酚的含量，为品种鉴定与质量评价提供科学参考。方法：采用高效液相二极管阵列检测法（HPLCDAD），色谱柱为Agilent C₁₈（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相为甲醇（A）0.1%磷酸溶液梯度洗脱（0～15 min，35%～50% A；15 ～30 min，50%～65% A），检测波长290 nm（花旗松素、柑桔素）和365 nm（槲皮素、山柰酚），柱温30 ℃。结果：花旗松素、槲皮素的含量柘树根明显高于构棘根，柘树茎明显高于构棘茎，种间含量差异大；柑桔素、山柰酚的含量构棘根高于柘树根，柘树茎与构棘茎含量相当，种间含量差异小，同种药用部位间含量差异大。结论：4种成分的含量在柘树和构棘及其药用部位根和茎都存在一定的差异，在临床上不可混淆使用。

[关键词] 柘树； 构棘； HPLCDAD

与构棘Cudrania cochinchinensis（Lour.）kudo et Masam.的根收载于1977年版《中国药典》 “穿破石”项下，具有止咳，退黄，活血，通络的功效，主要用于肺结核，湿热黄疸，胁肋疼痛，跌扑瘀痛，风湿痹痛等[1]。现代药理研究证明，柘树根及茎均具有较好的抗肿瘤作用，其主要成分为黄酮类化合物[2]，市售柘木糖浆用于晚期消化道肿瘤的治疗早有应用[3]。对于柘树的药用部位，药典收载为根，文献报道根及茎均可药用，而商品药材比较混乱，或单独为根、或根及茎混淆使用。而关于构棘的相关文献资料较少。据报道，花旗松素、柑桔素、槲皮素和山柰酚均具有一定的抗肿瘤作用[45]，本文对这4种成分进行了含量测定，通过比较分析，旨在为柘树、构棘的品种鉴定和质量评价提供科学参考，为临床正确用药提供科学依据。

1 材料

Agilent 1260型高效液相色谱仪，配置四元梯度泵、在线真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器；国产AR 级 2140型电子天平，METTLER AB135S 1/10万电子天平（瑞士）。

花旗松素、柑桔素、槲皮素、山柰酚对照品自制，经HPLC峰面积归一化法计算，纯度均大于98%。供含量测定用甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。

柘树C. tricuspidata的根及茎、构棘C. cochinchinensis的根及茎均由广西中医学院药学院中药鉴定教研室何报作教授采自南宁并鉴定。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent C₁₈（4.6 mm×150 mm，5 μm）色谱柱；流动相甲醇（A）0.1%磷酸水（B），梯度洗脱，0～15 min，35%～50% A；15～30 min，50%～65% A；柱温30 ℃；流速1 mL·min^-1；花旗松素、柑桔素检测波长为290 nm，槲皮素、山柰酚检测波长为365 nm；进样量10 μL。在上述色谱条件下，峰呈较好分离，色谱图见图1。

2.2 对照品的制备 取对照品花旗松素、柑桔素、槲皮素、山柰酚适量，精密称定，各加甲醇制成每1 mL含花旗松素0.958 mg、柑桔素1.320 mg、槲皮素0.632 mg、山柰酚0.450 mg的对照品储备液，摇匀，备用。

2.3 供试品溶液的制备 取柘树根、柘树茎、构棘根、构棘茎药材粉末（60目）约4 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加甲醇34 mL，25%盐酸17 mL，称重，回流提取2 h，冷却，补足失重，过滤，定容于100 mL量瓶，0.45 μm微孔滤膜滤过滤，即得。

1. 花旗松素；2. 柑桔素；3. 槲皮素；4. 山柰酚；a.290 nm；b.365 nm。

图1 对照品（A）及柘树根（B）的HPLC图

Fig.1 HPLC Chromatograms of reference substance （A） and the root of Cudrania tricuspidata （B）

2.4 线性关系考察 分别精密吸取花旗松素、柑桔素、槲皮素、山柰酚对照品储备液0.8，1.2，0.16，0.34 mL，置同一10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得混合对照品溶液。分别精密吸取混合对照品溶液5，8，10，15，20，25 μL注入高效液相色谱仪测定。以对照品进样量X（μg）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程，结果见表1。

2.5 精密度试验 精密吸取同一浓度混合对照品溶液10 μL，按2.1项下色谱条件，重复进样6次，记录峰面积。花旗松素，柑桔素，槲皮素，山柰酚峰面积的RSD分别为1.1%，0.94%，1.4%，1.2%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 精密吸取柘树根样品10 μL，分别于0，2，4，6，8，10 h分别进样分析，记录峰面积。花旗松素，柑桔素，槲皮素，山柰酚峰面积的RSD分别为1.1%，1.2%，0.70%，0.60%。表明供试品溶液在10 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验 精密称取柘树根样品6份，每份约2 g，按2.3项下方法制备供试品溶液，进样10 μL，记录各色谱峰峰面积。花旗松素、柑桔素、槲皮素、山柰酚峰面积的RSD分别为0.80%，1.1%，1.0%，0.90%，表明样品重复性较好。

2.8 加样回收率试验 取已知含量的柘树根样品6份（花旗松素0.629 4 mg·g^-1、柑桔素1.963 3 mg·g^-1、槲皮素0.089 5 mg·g^-1、山柰酚0.299 6 mg·g^-1），每份约2 g，精密称定，分别置圆底烧瓶中，精密加入对照品储备液花旗松素1.3 mL、柑桔素3.0 mL、槲皮素0.3 mL、山柰酚1.3 mL，按2.3项下方法制备供试品溶液，进样10 μL，记录各色谱峰峰面积，计算平均回收率，结果见表2。

2.9 样品的含量测定 按2.3项下方法制备供试品溶液，并按2.1项下色谱条件进行测定。柘树根、柘树茎、构棘根、构棘茎中花旗松素、柑桔素、槲皮素、山柰酚的平均含量见表3。

3 讨论

花旗松素的含量柘树根明显高于构棘根，柘树茎明显高于构棘茎，种间含量差异大，同种药用部位间含量差异小；柑桔素的含量构棘根高于柘树根，柘树茎略高于构棘茎，种间含量差异小，同种药用部位间含量差异大；槲皮素的含量柘树根明显高于构棘根，柘树茎明显高于构棘茎，种间含量差异大，同种药用部位间含量差异亦大；山柰酚的含量柘树根略低于构棘根，柘树茎与构棘茎含量相当，种间含量差异小，同种药用部位间含量差异大。上述结果可以归纳为：柘树和构棘的根中4种成分的含量均高于柘树和构棘的茎，其中花旗松素的含量差异不大，其余三者差异较大；柘树和构棘的种间差异体现在花旗松素、槲皮素的含量，两者的含量均是柘树（根、茎）明显高于构棘（根、茎），而柑桔素和山柰酚的含量在柘树（根、茎）和构棘（根、茎）之间的差异不大。4种成分的含量在柘树和构棘的不同药用部位、柘树和构棘之间存在一定的差异，在临床上不可混淆使用。

3.1 检测波长的选择 花旗松素和柑桔素的最大吸收波长为290 nm，槲皮素和山柰酚最大吸收波长为365 nm。如图1所示，各成分在2个波长下的响应值相差较大，故选择290，365 nm同时测定，方法更简单，结果更准确。

3.2 提取方法的选择 柘树与构棘的根及茎中槲皮素与山柰酚大多以糖苷的形式存在[6]。实验中发现，未经水解的样品两者的含量较低，水解后含量显著升高，同时花旗松素和柑桔素的含量不受水解的影响，故本文对样品进行了酸水解处理。采用以下2种方法进行提取方法研究，方法1：称柘树根样品2.5 g，置于圆底烧瓶中，加甲醇50 mL，称重，回流提取1 h，冷却，补足失重，过滤，精密移取续滤液10 mL，加入25%盐酸2.5 mL，水浴回流水解30 min，快速冷却，定容于25 mL量瓶，取样，过滤，作为供试品溶液。方法2：称柘树根样品4 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入甲醇40 mL，25%盐酸10 mL，称重，回流提取1 h，冷却，补足失重，过滤，定容于100 mL量瓶，取样，过滤，作为供试品溶液。结果方法1测得槲皮素、山柰酚质量分数为0.042 6，0.171 8 mg·g^-1，方法2测得槲皮素、山柰酚质量分数为0.082 2，0.250 1 mg·g^-1，表明方法2测得两者的含量更高，且操作简单可行，故选取方法2作为制备供试品的方法。

3.3 提取条件的研究 考察了甲醇25%盐酸溶液的比例（1∶1，2∶1，3∶1，4∶1）、不同提取水解时间（1，1.5，2，2.5 h）对提取效率的影响，结果表明：用甲醇25%盐酸（2∶1），水解提取时间2 h，即能水解完全，且能保证pH不会太低。

本实验通过测定柘树与构棘根及茎中花旗松素、柑桔素、槲皮素、山柰酚的含量，分析比较了2个药材品种及其2个药用部位间4种黄酮类成分的含量差异，为指导临床准确用药，为药材品种的鉴定与质量分析提供了科学依据。

[参考文献]

[1] 中国药典.一部[S].1977：443.

[2] 张志，吴海健，皮恩浩，等.柘树黄酮体内外抗肿瘤作用研究[J].世界临床药物，2009，30（10）：601.

[3] 杜卫东，沈达明，宋晓华，等.柘木糖浆对胃肠道肿瘤手术后化疗病人肿瘤标记物和细胞免疫的影响[J].临床医药杂志，2004，17（3）：11.

[4] Ju Hyung Lee，Chi Hoon Park，Kyung Chae Jung，et al. Negative regulation of βcatenin/Tcf signaling by naringenin in AGS gastric cancer cell [J]. Biochem Biophys Res Commun，2005，335（3）：771.

[5] 廖峥嵘，沈永清，赵娟，等.山柰酚对人小细胞肺癌H446细胞凋亡的影响[J].河北师范大学学报：自然科学版，2011，35（5）：510.

[6] 李正言，翟延君，腾宇，等.不同商品柘木中槲皮素和山柰酚的含量测定[J].时珍国医国药，2009，20（9）：2186.

Simultaneous determination of four flavones in root and

stem of Cudrania tricuspidata and C. cochinchinensis by HPLCDAD

LI Bo， WANG Mei， TAN Yanan， TONG Miaomiao， ZHAI Yanjun*

（College of Pharmacy， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Dalian 116600， China）

[Abstart] Objective： To establish a HPLCDAD method for the determination of axifolin， naringenin， quercetin and kaempferol in Cudrania tricuspidata and C. cochinchinensis in order to provide a scientific reference for species identification and quality evaluation， by establishing. Method： The determination was performed by HPLCDAD on an Agilent C₁₈ column （4.6 mm×150 mm，5 μm） by gradient elution （015 min，35%50% A；1530 min，50%65% A） using methanol （A） and 0.1% phosphoric acid （B） as the mobile phase. The flow rate was 1 mL·min^-1. The detection wavelength was 290 nm for taxifolin and naringenin，365 nm for quercetin and kaempferol with column temperature at 30 ℃. Result： The content of axifolin and quercetin in the root of C. tricuspidata were remarkably higher than that in the root of C. cochinchinensis，and the content in stem of C. tricuspidata was also higher than that in the stem of C. cochinchinensis，the content of axifolin and quercetin was variable in different species. The content of naringenin and kaempferol in the root of C. cochinchinensis was visibly higher than that in the root of C. tricuspidata， and the content in the stems of the two herbs was similar， the content of naringenin and kaempferol was visibly variable in different medicinal parts of the herb， but similar between the two herbs. Conclusion： There′s some difference of the content of the four ingredients in different medicinal parts and different herbs， so clinical use should not be confused.

[Key words] Cudrania tricuspidata； Cudrania cochinchinensis； HPLCDAD

doi：10.4268/cjcmm20130205

[责任编辑 吕冬梅]