锌指转录调节蛋白KLF4在喉鳞状细胞癌组织中的表达及意义

许明 沈宝茗 江青山 周芝芳 唐洪波

·论著·

锌指转录调节蛋白KLF4在喉鳞状细胞癌组织中的表达及意义

许明 沈宝茗 江青山 周芝芳 唐洪波

目的 检测锌指转录调节蛋白KLF4在喉鳞状细胞癌组织中的分布、表达及其与临床特征的关系。方法 采用免疫组化染色法检测并分析KLF4在48例经病理确诊为喉鳞状细胞癌组织中的分布及表达, 以56例声带息肉组织作为对照。结果 KLF4蛋白在喉鳞状细胞癌及声带息肉组织的表达差异有统计学意义。同时, 高分化鳞癌与低分化鳞癌的表达差异有统计学意义。结论 KLF4可能在喉鳞状细胞癌的发生发展中起了重要作用, 并且可能主导了肿瘤的分化程度。

锌指转录调节蛋白；喉鳞状细胞癌；免疫组化；意义

锌指转录调节蛋白KLF4是近年发现的一个新型转录调节因子蛋白, KLF4蛋白基因通过激活或抑制其上游或下游目的基因的转录而调节细胞的生长、分化、凋亡、增殖, 或者被其他因子影响以共同调节转录, 最终实现维持细胞周期和机体内环境的稳定。由于肿瘤的生物学特征是细胞的异常增生和分化以及在组织内的侵袭性, 因此认为KLF4在肿瘤的发生、发展过程中可能起着调控作用。本研究采用免疫组化技术对48例喉鳞癌组织及56例声带息肉组织中KLF4蛋白表达情况进行研究, 以探讨KLF4蛋白在喉鳞癌发生发展中的作用及其与临床病理参数之间的关系。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 本研究收集自2003～2008年南华大学第一附属医院48例喉鳞癌及56例声带息肉手术存档及活检石蜡标本, 病例资料完整。所有标本均经本院病理学专家阅片2次,确诊为喉鳞状细胞癌及声带息肉。并且所有标本均经10%中性甲醛固定, 石蜡包埋, 4 μm连续切片。

1. 2 试剂 MaxvisionTMHRP-Polymer anti-Rabbit IHC kit(编号：KIT-5004)、DAB显色剂(编号：DAB-0031)、苏木苏体C快速染色液(编号CTS-1099)均购自福州迈新生物技术有限公司。兔抗人KLF4多克隆抗体(编号：bs-1064R)购自北京博奥森生物技术有限公司。

1. 3 方法 采用免疫组化二步法。常规石蜡切片脱蜡、梯度酒精水化, 柠檬酸沸水加热抗原修复, 3%双氧水孵育, PBS冲洗, 加KLF4一抗(按说明书稀释度为1：1000)室温孵育1 h后PBS冲洗3次, 滴加MaxvisionTMHRPPolymer anti-Rabbit IHC室温孵育30 min后PBS冲洗3次, 滴加DAB显色剂, 目测显示棕黄色时PBS冲洗, 苏木苏复染, 脱水, 中性树胶封片。显微镜下观察并照相。

1. 4 结果判定 用半定量的方法, 根据参考文献［1］的标准及方法判定结果。选择切片中具有代表性的区域, 由2名资深病理医师以盲法行免疫组画染色观察并计算积分。根据阳性细胞数的比例和染色强度行半定量积分:无阳性细胞为0 分; 阳性细胞1%～10%为1分; 11%～30%为2分; 31%～50%为3分; 51%～80%为4分; 81%～100%为5分。染色强度: 阴性为0分; 弱阳性为1分; 中等阳性为2分; 强阳性为3分。两者相乘获得最终积分, 理论上分值为0～15 分; ≥3分定为阳性或高表达; 0～2分为无阳性表达。

1. 5 统计学方法 统计分析运用SPSS13.0软件。实验数据采用χ2检验, P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 KLF4蛋白在喉鳞癌组织中的表达 KLF4蛋白阳性反应的细胞, 其着色部位主要在细胞质内, 见图1～3。喉鳞状细胞癌与声带息肉上皮细胞中KLF4蛋白阳性率分别为73%和91%,两者差异存在统计学意义(P＜0.05), 见表1。

2. 2 KLF4蛋白的表达与喉癌临床特征的关系 KLF4蛋白的表达与喉癌的组织分化程度有关, 高分化鳞癌与中分化鳞癌的阳性率比低分化鳞癌高(P＜0.05), 见表2。

图1 声带息肉高表达

图2 高分化鳞癌高表达

图3 高分化鳞癌低表达

表1 KLF4蛋白在喉鳞状细胞癌及声带息肉上皮细胞中的表达

表2 KLF4蛋白的表达与喉癌临床特征的关系

3 讨论

锌指转录调节蛋白KLF4是近年发现的一个新型转录调节因子蛋白, 因其首先在小鼠去血清处理的NIH3T3细胞cDNA文库中获得该基因, 而其表达主要在胃肠道上皮, 因此也命名为胃肠富集Krupple样因子。KLF4蛋白基因通过激活或抑制其上游或下游目的基因的转录而调节细胞的生长、分化、凋亡、增殖,或者被其他因子影响以共同调节转录, 最终实现维持细胞周期和机体内环境的稳定。但是到目前为止, 人们对KLF4的生理功能了解不多。现已被证实的其下游能被激活的目的基因有角蛋白4, 角蛋白19, P21WAF1/Cip1、EBV ED-12、γ球蛋白、CD14等基因的启动子, 对β球蛋白、细胞色素P450 CYPIA1、细胞周期素Cyclin D1、P53等基因的启动子则是抑制作用。KLF4蛋白在大多数消化道恶性肿瘤中的表达研究已有相关报道。在Apc(Min)/(Apc(Min/+))鼠和Apc(Min)/ (Klf4(+/-)/ Apc(Min/+))鼠的肠内腺瘤生长中, KLF4蛋白水平和mRNA水平随着肿瘤的长大而下降,表明KLF4在 Apc(Min)突变肠内腺瘤生长过程中有重要的作用。此外, 在其他肿瘤中, 如子宫内膜癌［1］、宫颈鳞癌患者［2］, KLF4的表达也是下调的。而在喉鳞癌中KLF4的表达研究国内外少见文献报道。本文以KLF4蛋白在喉鳞状细胞癌中的表达作为研究内容, 根据所查阅绝大部分的相关文献判断蛋白表达情况标准为标准, 这样能较好的反映研究蛋白的表达情况。

近年来的研究表明, KLF4蛋白在消化道大部分上皮细胞来源的恶性肿瘤中的表达下调, 并且在肿瘤的发生、发展等多个环节发挥作用。KLF4蛋白基因通过调节其他基因或被其他基因调节, 从而影响细胞遗传信息的改变。目前对KLF4在肿瘤组织中表达下调的机制还不明确。研究发现, 在手术切除的结肠直肠癌标本和结肠直肠癌细胞株中, 部分标本KLF4的开放读码框有点突变, 这就可能引起了KLF4的表达下降, 不能有效激活P21(WAF1/Cip1)启动子, 以进一步激活P53诱导的细胞凋亡［2］, 从而导致不能正常抑制细胞的增殖以至于造成细胞的异常增生和肿瘤的形成。此外, 硒元素可以增加KLF4的表达, 并且使用KLF4敲除短期干扰RNA明显减弱了在DNA合成抑制、细胞凋亡诱导作用和三个KLF4目的基因Cyclin D1, P21/WAF1,和p27/Kip1的表达中硒的作用效果, 可以引起癌细胞的继续增殖, 因此, KLF4可能通过KLF4-P21或p27/Kip1-P53的转录抑制或激活系统来调控肿瘤细胞的生长和发展［3］。

本研究应用免疫组化SP法检测48例喉鳞状细胞癌中KLF4的表达阳性率为73%, 在56例声带息肉组织中阳性表达率为91%, 两者比较差异有统计学意义(P＜0.05)。喉鳞状细胞癌中高分化鳞癌的阳性表达率为85%, 而低分化鳞癌的阳性表达率为(22%), 两者比较差异有统计学意义(P＜0.01)。作者认为, KLF4在喉鳞状细胞癌的发生发展过程中可能起着重要的作用, 并且随着喉鳞状细胞癌的分化程度的降低其主导肿瘤发生的作用越大。

［1］ 刘红. 子宫内膜癌组织锌指蛋白KLF4的表达及临床意义. 山东医药, 2005, 45(24):29.

［2］ 刘红. 胃肠富集Kruppel因子GKLF在宫颈鳞癌中的表达及意义. 泰山医学院学报, 2004,25(5): 425-428.

［3］ Hart GT. Kruppel-like factors in lymphocyte biology. J Immunol, 2012,188(2):521-526.

Expression and significance of zinc finger transcription adjection protein in laryngeal squamous cell carcinoma

XU Ming, SHEN Bao-ming, JIANG Qing-shan, et al. Department of Otorhinolaryngology, First Hospital Affiliated to University of South China, Hengyang 421001, China

objective To investigate the relation of distributions and expressions of the zinc finger transcription adjection protein KLF4 with clinical histological characteristics in laryngeal squamous cell carcinoma(LSCC). Methods The distributions and expressions of KLF4 were examined with immunohistochemical staining in 53 specimens which were diagnosed by pathology , and comparing with 44 specimens of polyp of vocal cord(PVC). Results The differences of expressions of KLF4 between LSCC and PVC were statistically significant(P＜0.05).At the same time, the differences between well-differentiated and poolydifferentiated laryngeal squamous cell carcinoma were statistically significant also(P＜0.05). Conclusion KLF4 may play a important role in the generation and evolution of LSCC, and decide the differentiation degree of LSCC.

Zinc finger transcription adjection protein; Laryngeal squamous cell carcinoma; Immunohistochemical staining; Significant

R739.65

A

1674-9316(2013)22-0001-03

10.3969/J.ISSN.1674-9316.2013.22.001

421001 南华大学附属第一医院耳鼻咽喉科