酶稳定化技术及其在洗涤剂开发中的应用

谷志静，赵泽华，胡卫华，何永志，赵文忠

（1.拉芳家化股份有限公司，广东 汕头 515065；2.中国科学院-拉芳发质研究中心，北京 100101）

酶稳定化技术及其在洗涤剂开发中的应用

谷志静1,2，赵泽华1，胡卫华1，何永志2，赵文忠1

（1.拉芳家化股份有限公司，广东 汕头 515065；2.中国科学院-拉芳发质研究中心，北京 100101）

酶的稳定性问题是影响其在洗涤剂中应用性能的重要因素。综合运用蛋白质工程﹑化学修饰﹑稳定剂添加和微囊包载技术可增强酶的稳定性，提升加酶洗涤剂的使用效果。本文概述了4种酶稳定化技术的基本原理及其研究现状；介绍了酶稳定化技术在洗涤剂开发中的应用进展和发展前景。

酶制剂；稳定性；洗涤剂；应用

1．前言

早在1913年，Ro..hm就已将胰腺提取物用于洗涤剂的预浸泡组分Burnus，开创了生物酶在洗涤剂工业中应用的历史。国外已商品化的洗涤剂用酶主要为水解酶类，包括碱性蛋白酶﹑淀粉酶﹑碱性纤维素酶﹑脂肪酶以及它们的复合物；新开发的抗染料转移功能或消毒杀菌效用的氧化还原酶类（如过氧化氢酶）也具有较好的应用前景。

生物酶作为洗涤助剂是合成洗涤剂工业发展过程中的重大技术进步之一，它促进了洗涤剂工业的可持续发展：降低了洗涤剂中表面活性剂和三聚磷酸钠的用量，有助于低磷或无磷洗涤剂的开发；能够改善洗涤性能，但自身无毒并能完全生物降解，可以减少污染物质的排放；降低洗涤温度，减少漂洗次数，有利于节能节水。

但是，由于生物酶自身易于降解以及洗涤剂配方技术的复杂性，如表面活性剂﹑漂白剂﹑蛋白酶等配方组分以及pH﹑温度等配方条件的影响，酶的稳定性成了加酶洗涤剂配方的突出问题[1-2]。酶制剂公司和洗涤用品开发商通过综合运用蛋白质工程技术﹑化学修饰技术﹑稳定剂添加和微囊包载技术，来提高生物酶在洗涤剂中的稳定性，改善其使用效果。

2．蛋白质工程技术

蛋白质工程技术主要是对已知酶分子一级结构的改变，即酶的主链氨基酸的替换修饰。随着二十世纪70年代基因重组技术的建立，人们通过生产菌株和表达系统的改造，大幅度提高了重组酶的表达效率；80～90年代，通过基因重组技术结合计算机辅助设计，逐渐形成了以理性设计和定向进化策略为主的蛋白质工程技术。

借助蛋白质工程技术，人们可以根据实际应用需要改进重组酶的性能，使酶制剂得以实现规模化应用。在洗涤剂用酶的开发过程中，经常采用理性设计和定向进化相结合的改性方式来改善酶的稳定性及综合洗涤效能。目前，洗涤用品工业中应用的商品化酶制剂80%已升级为性能更加优越的蛋白质工程突变体。例如，诺维信公司开发的蛋白酶制剂EverlaseTM是SavinaseTM的抗漂白剂突变体；而DurazymTM（诺和诺德公司，丹麦）﹑RelaseTM（诺和诺德公司，丹麦）﹑MaxapemTM（Gist-Brocades，荷兰）﹑Purafect OxPTM（杰能科公司，美国）﹑WuxiTM（无锡联合生物制品有限公司，中国）都是蛋白质工程重组酶。此类酶制剂在洗涤用品工业应用所受到的限制较食品行业少，因而获得了更为广泛的认可。

2.1 理性设计及应用

对于那些三级结构已经比较清楚的酶分子，可以通过PCR﹑寡核苷酸盒技术，对特定区域的核苷酸序列进行定点突变或进行一段序列的置换等理性设计，进而改变酶蛋白的功能性质。理性设计实验的工作量相对较小，但前提是熟悉酶的结构及其与功能的关系，并需要大量的生物信息学辅助工作。

关于蛋白质工程的模式酶——枯草芽孢杆菌蛋白酶（Subtilisin），现已有50多种高清晰度的X-ray结构解析模型。结合同源序列比对和蛋白结构分析，确定合适的位点进行突变，然后通过Kcat/Km﹑温度稳定性﹑pH稳定性﹑氧化稳定性﹑表面活性剂稳定性等方面对酶学性质进行分析，选择建立适合突变体的设计流程，使得理性设计在理论研究的基础上发展成为改善酶稳定性的捷径。

根据酶制剂公司和日化公司发表的专利技术总结，与酶的洗涤稳定性相关的位点修饰包括：将Subtilisin BPN'﹑蛋白酶K﹑Subtilisin Carlsberg疏水区域的疏水氨基酸Pro129﹑Pro131﹑Ile165﹑Tyr167﹑Tyr171及其临近的非疏水氨基酸Glu136﹑Gly159﹑Ser164﹑Arg170﹑Ala194﹑Gly195位点替换为更疏水的氨基酸残基，可以提高酶对离子强度的稳定性，从而使之能耐受硬水洗涤条件；改变金属离子的结合位点，采用负电荷的氨基酸置换Subtilisin钙离子结合位点的氨基酸，如将Subtilisin BPN'﹑Carlsberg﹑DY的Gly131替换为Asp和/或将Pro172替换为Asp或Glu，有利于加强钙离子和结合位点的静电吸引，从而提高酶的稳定性；置换Subtilisin BPN′未形成二硫键的甲硫氨酸Met222，有利于提高酶的抗氧化性和对漂白剂的耐受性[3]。此外，Acevedo等人通过对南极嗜冷细菌的Subtilisin序列分析和定点突变，证实284位的丙氨酸对其嗜低温性有关键作用，为低温蛋白酶的定点突变设计提供了有效的理论依据[4]。

2.2 定向进化及应用

定向进化是在不需要事先了解蛋白质空间结构的情况下，模拟自然进化机制，通过对编码基因的体外随机突变﹑重组和定向筛选，获得具有改进功能或全新功能的酶蛋白。体外定向进化是蛋白质工程的新策略，其快速发展有力地推动了生物酶制剂的商业化开发。定向进化以随机诱变和体外重组构建序列多样性文库为研究基础。

传统的随机诱变方法操作繁琐，已逐渐为新的体外基因重组技术所取代。体外重组是基于PCR原理发展起来的突变文库构建方法，包括易错PCR（error PCR）和体外随机拼接（DNA shuffling）两种方案。前者在酶基因的PCR扩增反应中，利用TaqDNA多聚酶不具有3'～5'校对功能，以每个基因2～5个碱基的替换比率向目的基因中引入突变；后者是将进化上相关的或者独立的基因片段重新组合，从而引入大量突变。

21世纪以来，研究人员先后开发了序列饱和突变法（sequence saturation Mutagenesis，SeSaM）﹑不依赖于同源性的蛋白质重组方法（sequence homology-independent protein recombination，SHIPREC）等20多种改进的序列多样性文库构建方法，特别是小型但正向突变率较高的突变库的构建技术以及系列由shuffling衍生出的嵌合酶构建技术，克服了传统定向进化策略效率低﹑假阳性率高的弊端，加速了定向进化技术的应用进程。Bryan实验室通过易错PCR引入12个位点突变，获得了高活性﹑高稳定性的蛋白酶复合进化突变体，在比活性没有改变的情况下，半衰期提高到原来的15000倍[5]；Li等人通过SeSaM定向进化方法，对Subtilisin E进行趋化性改造，获得对变性剂GdmCl和表面活性剂SDS的耐受性显著增强的突变体SeSaM1-5（S62I/A153V/G166S/ I205V），该突变体在2% SDS中的半衰期延长至野生型的27倍[6]；Martinez等则通过SeSaM随机突变和传统的微孔板筛选法，获得了在15℃低温时酶活提高1.5倍﹑60℃高温时半衰期延长了100倍的蛋白酶突变体MF1，它既可用于低温型洗衣液，也可用于高温的餐具洗涤剂[7]。

3．化学修饰技术

在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团进行共价连接，从而改变酶的结构和性质，即酶的化学修饰。化学修饰为蛋白侧链修饰，作用于蛋白质分子的氨基﹑羧基﹑羟基﹑巯基和酰胺键等部位。追溯酶化学修饰的研究历史，早在20世纪50年代末就已经有人开始了关于酶的化学修饰技术的探索，当时主要用来研究酶的结构与功能的关系；20世纪70年代末以后，化学修饰技术逐渐向应用过渡。现有的化学修饰技术研究结果显示，生物相容性大分子修饰和肽链交联技术适合于洗涤剂用酶制剂的稳定性改造[8]。

3.1 大分子修饰

大分子修饰是一种利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，进而改变酶的理化性质与功能的方法。大分子修饰剂本身是多聚电荷体，它能在酶分子表面形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，并通过静电斥力或者空间障碍阻挡抑制剂﹑蛋白酶的接近，维持酶活性部位微环境相对稳定。

淀粉﹑环糊精﹑聚蔗糖等大分子糖苷经过氧化处理后修饰酶蛋白具有较好的稳定作用。聚乙二醇（PEG）既能溶于水又能溶于大多数有机溶剂，且其自身没有抗原性﹑毒性，生物相容性好，所以已成为日化﹑医药﹑食品领域应用最为广泛的大分子修饰剂，既可用于提高生物酶的体外的稳定性，又可用于改善生物酶的体内稳定性。

3.2 蛋白质肽链交联

蛋白质肽链交联指通过具有两个反应活性部位的双功能试剂，在相隔较近的两个氨基酸残基间搭桥，形成多肽链内﹑多肽链间或者蛋白质分子之间的交联，而不会引起蛋白质构象的重大改变。这种方法也称为蛋白修饰。

双功能交联试剂分为同型交联剂和异型交联剂。前者主要与胺基反应，如戊二醛（PGA）；后者一端与巯基侧链作用，另一端与胺基作用，如碳二亚胺（EDC）。其他常用的交联剂有羰基二咪唑﹑异氰酸衍生物﹑双氮联苯﹑N,N-聚甲烯双碘丙酮酰胺和N,N-乙烯双马来酰亚胺等。

采用多反应基团的交联剂修饰可与酶形成多点交联，使酶的天然构象产生“刚性”结构，从而增强酶天然构象的稳定性。而且酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。Subtilisin Carlsberg通过PEG修饰和羰基二咪唑交联固定，在洗涤剂中半衰期可延长约2倍[9]。

4．稳定剂添加技术

在含有大量水分的液体洗涤剂中，酶通常更不稳定。极性的溶剂﹑缓冲剂以及带电荷的表面活性剂等组分可能促使储存过程中酶的三级结构解折叠，而且蛋白酶在水溶液中更容易降解其他生物酶。添加适量稳定介质以抑制蛋白酶活性﹑调节电荷平衡﹑加强渗透保护，从而保障生物酶结构的刚性是解决液洗用酶稳定性的主要技术方案，即稳定剂添加技术。目前，该技术的研究重点是开发高效的蛋白酶抑制剂和适合配方的复合稳定体系。

4.1 蛋白酶可逆抑制剂

蛋白酶的可逆抑制剂能够与蛋白酶的活性位点实现可逆结合，它可以使液体酶在货架期间是稳定的﹑无活性的，而使用时则以不同方式释放活性。有机硼酸盐作为枯草芽孢杆菌蛋白酶抑制剂，其稳定效果因取代基不同而不同，甲基﹑丁基﹑2-环氧乙烯基硼酸盐的抑制作用较差，以甲基硼酸盐效果最弱，芳香基取代的有机硼酸盐抑制作用较强。

21世纪以来，诺维信公司和宝洁公司都着重开发含芳基的有机硼酸盐作为蛋白酶抑制剂，并发现芳香基团-3位与硼酸缩合的有机硼酸盐的效果最优[10-11]。然而，动物实验结果将硼酸盐确定为第二类生殖毒性化合物，因此人们正积极寻找新的稳定剂作为液体洗涤剂中硼酸盐替代物。

研究人员发现，在加入蛋白酶的液体洗涤剂中，α-羟基羧酸盐对酶的稳定性起到关键作用。特别是含芳香基的羧酸盐衍生物更有效，使之成为新一代蛋白酶抑制剂的主流产品。诺维信公司近期开发了3-氯苯甲酸﹑4-氯苯甲酸﹑3-氯苯乙酸﹑3,5-二氯苯甲酸﹑3-(3-氯苯基)丙酸等多种带有芳香基的羧酸盐衍生物作为枯草芽孢杆菌蛋白酶抑制剂，其最低添加量只有0.001%（w/w），因而可以大大降低配方成本。而且，它较硼酸盐具有更好的生物降解性[12]。

4.2 复合稳定体系

洗涤剂的表面活性剂组成以及其pH范围﹑水含量等理化条件，都会在不同程度上影响蛋白酶抑制剂的稳定作用[2]。因此，需要根据洗涤剂的配方特点，设计蛋白酶抑制剂和小分子添加剂组成的复合稳定体系。其主要设计原理是，通过小分子添加剂2～6元醇降低组合物中的水含量（≤70%），这样蛋白酶可逆抑制剂才能有效地封闭蛋白酶活性区。

市售加酶液体洗涤剂的稳定体系主要由硼酸盐（1%～3%）和丙二醇/丙三醇（＞5%）组成，但液体洗涤剂配方中不能配用过多的阴离子表面活性剂。例如，宝洁公司2009年开发设计的一款产品，就是由1%～5%硼酸盐﹑0.1%～7%丙二醇﹑10～50毫摩尔CaCl2.2H2O 组成的稳定体系，在40%～70%的水含量条件下，可增强淀粉酶﹑蛋白酶﹑碱性磷酸酯酶等多种生物酶的稳定性[13]。

在大量的蛋白酶抑制剂和稳定体系开发的基础上，2012年陶氏化学公司开发了只添加1～3%等比例混合硼酸盐和α-羟基单羧酸盐的酶稳定体系，其中α-羟基单羧盐以乳酸﹑扁桃酸的钙盐为佳，硼酸盐以苯基硼酸盐为佳。该公司宣称，这种稳定体系在pH2～10范围内对多种酶浓缩液和洗涤剂广谱适用[14]。可见，洗涤配方中酶的稳定体系正向着成分简化﹑浓度降低，但性能更加高效和广谱的方向发展。

5．微囊包载技术

利用成膜材料（简称壁材），将固体或液体活性物以及易挥发的原料包裹成大小为1～5000μm的封闭囊，使囊内空间与囊外空间隔开，统称为微囊包载技术。通过该技术，可将生物酶与洗涤护理产品中的破坏性组分进行隔离，以保护酶的生物学活性。

早期微囊包载酶制剂主要以颗粒酶的形式用于固体洗衣粉。这些颗粒酶由含酶核心结构和包衣层构成，制备材料按用途分为成膜剂﹑黏合剂﹑填充剂﹑制粒剂及抑制粉尘的脂肪酸盐或高级醇。二十世纪90年代后，微囊化酶制剂的开发应用领域拓展至液体洗涤剂。因此，微囊自身的机械稳定性﹑热稳定性和冻融稳定性已成为选择和评价液体洗涤剂微囊的重要指标。

微囊化研发过程中，要根据包芯性质﹑组合物配伍性﹑活性物释放环境等具体应用条件，选用不同的壁材和制备方法。目前开发的酶微囊，主要以无机盐或聚蔗糖为填充剂或渗透平衡剂，以合成聚合物（聚乙二醇﹑乙烯基聚合物﹑吡咯烷酮聚合物﹑丙烯酸聚合物﹑乙基纤维素聚合物等）或天然大分子化合物（海藻酸（盐）﹑壳聚糖﹑角叉菜胶﹑黄原胶﹑脂肪酸﹑蜡﹑膨润土等）以及其复合材料作为包衣。根据囊壁形成的原理，微囊包载方法可概括为化学反应法﹑物理机械法﹑物理化学法三大类，工艺流程分为芯材分散﹑壁材加入﹑壁材沉积及壁材固化四个主要步骤[15,16]。

5.1 化学反应法

化学反应法微囊包载技术是指利用单体小分子发生聚合反应，生成高分子成膜材料包覆芯材的微囊制备方法。这种技术主要包括界面聚合法和原位聚合法。诺维信公司采用原位聚合法开发了一种由环氧乙烷（EO）﹑环氧丙烷﹑丙烯酸（EE）或乙烯胺的低分子量聚合体（＞10个单体）构成的二元共聚物（如PEO-40-PEE-37）或三元共聚物（如PEO-40-PEE-74-PEO-40）为主要壁材的微囊，其共聚物组分占微囊的50%～100%（w/w）。此种微囊囊壁既有亲水性又有疏水性，既可以包载酶等水溶活性物也可以包载油溶性的香精[17]。

5.2 物理机械法

指利用机械或其他物理作用形成囊壁的方法，常用喷雾干燥法﹑气悬浮成膜法﹑真空蒸发沉积法﹑包结络合法﹑溶剂蒸发法﹑挤压法等。其中，喷雾干燥最适合工业化批量生产，其主要工艺为：芯材和壳材溶液合并在一起，通过喷雾干燥或喷雾冷却技术进行包裹，雾化后的液滴在气流中干燥或冷却固化，形成微囊。

二十世纪90年代是固体洗涤剂和液体洗涤剂市场竞争激烈的时期。宝洁公司公开了以洗涤助剂沸石为主要填充剂（3～97%），配合具有表面活性的成膜剂（0.1～25%）氧化胺聚合物﹑N-乙烯吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑聚合物或共聚物﹑马来酸及丙烯酸聚合物或共聚物共混包埋制备的酶微囊颗粒的专利技术。利用此项专利技术制备酶微囊颗粒，不仅适合固体洗涤剂中添加，也是最早开发的适用于液体洗涤剂的微囊[18]。

针对液体洗涤剂和潮湿环境酶的稳定储存问题，诺维信公司设计了一种高持水性微囊颗粒，其水溶性成分＞60%，包括pH＜11的碱金属或碱土金属的磷酸盐﹑亚硫酸盐﹑硫酸盐﹑盐酸盐﹑碳酸盐和碳原子数小于10的有机酸盐。其制备工艺为，将含有酶的核心材料在流化床上流化，通过喷雾将含有水溶性化合物的液体介质引入流化床，使非挥发性化合物沉积在酶核心材料上形成固体包衣，同时除去液体介质。这种微囊充分利用了低分子水溶性化合物的填充效果和吸湿性质，既有利于保持高湿环境中酶的储存稳定性，而且可以降低喷雾干燥的能耗[19]。

5.3 物理化学法

物理化学法微囊包载技术主要包括水相聚合法﹑油相聚合法﹑复相乳液法等。基于聚合物阴阳离子静电作用将聚电解质沉积到酶颗粒上，形成聚电解质薄膜的水相聚合方法，是近来发展较快的微囊制备方法。宝洁公司以壳聚糖﹑四聚壳聚糖或其混合物为阳离子聚合物，海藻酸盐（甘露糖醛酸单元（M）∶古罗糖醛酸单元（G）＝1.5∶1～4∶1）为阴离子聚合物，开发了可包载酶等多种生物活性物的功能性微囊[20]。制备此微囊时，将壳聚糖阳离子胺基与海藻酸阴离子通过正负电荷吸引形成复合物，溶解度降低，自体系中凝聚形成聚电解质半透膜。其显著优点是，制备过程温和﹑快捷﹑微囊化的酶活性损失小。这种生物材质微囊的刺激性小，具有良好的生物降解性，不仅适用于液体洗涤剂，还被开发用于洗护发产品的活性物添加[16]。

6．应用前景展望

中国洗涤用品工业“十二五”规划纲要中提出了加快产品结构调整的基本思路，明确要求“加强酶制剂在洗涤剂中的应用研究，促进加酶洗涤剂产品的发展，研究用生物酶取代部分化学品从而减少化学品的使用和排放”。在西欧﹑日本和美国等发达国家，加酶洗涤剂占洗涤剂市场的80%～95%，在国内加酶洗涤剂所占比例为60%左右。可见，酶制剂在我国洗涤用品中的应用具有广阔的增长空间。

采用合理的技术方法突破酶的稳定性限制瓶颈，提高洗涤剂的性价比，是我国洗涤用品工业需要面对的挑战。笔者认为，在现有技术的基础上，洗涤剂行业还应在以下四方面加大投入，以取得自主创新的知识产权，提升行业竞争力：

1）蛋白质工程技术和化学修饰仍是酶制剂稳定化的基础，其有效结合将提供更具有商业价值的酶制剂稳定化技术方案，如在获悉酶结构﹑功能和理化性质等信息的前提下，通过定向进化方法和定点的化学修饰结合，开发“杂合型酶”是酶稳定化技术的新热点；

2）开发新型载体材料是酶微囊包载技术的研究重点，今后还要在寻找原料易得﹑价廉﹑生物降解性好﹑低刺激性或者适用范围广的材料上寻求微囊技术广泛应用的突破口；

3）针对液体洗涤剂的酶稳定性改造技术将更加受到关注，稳定剂添加技术的应用还不能突破洗涤剂含水量和表面活性剂类型的限制，若与微囊包载技术﹑化学修饰技术适度整合，则可能更有效地克服其局限性；

4）配方师不仅要以酶制剂在洗涤剂中的半衰期作为考察指标，而且要以洗涤效果为重要参考，根据使用条件和成本选择适宜的稳定性技术，对加酶配方进行具体优化，以开发更高效的加酶液洗涤剂。

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