RP-HPLC 法测定泽兰中桦木酸的含量

李 超，钱士辉*

(1.南京中医药大学，江苏 南京210046;2.江苏省中医药研究院，江苏 南京210028)

泽兰(Lycopi Herba)是唇形科植物毛叶地瓜儿苗(Lycodus lucidus Turcz. var. hirtus Regel)的干燥地上部分，具有活血调经、祛淤消痈、利水消肿的功效［1］，为临床常用的活血化瘀类中药，广泛分布于东北、华北、华东、中南、西南及陕西甘肃等地。文献报导泽兰中含有三萜酸类、酚酸类、黄酮类、挥发油等多种化学成分［2-3］。《中华人民共和国药典》(2010)一部中只规定了泽兰中乌索酸的定性鉴别，尚无定量控制方法［4］。本课题组对泽兰进行了较为系统的化学成分研究［5］，本文首次报导采用HPLC 法测定来自江苏、安徽共10 个批次泽兰中的桦木酸的含量，为泽兰药材质量标准的制定提供了参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters2695 高效液相色谱仪(四元泵自动进样系统);Waters2996 二极管阵列紫外检测器;Empower 化学工作站(美国沃特世公司);METTLER TOLEDO AT-201 十万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司);BUCHIR -200 旋转蒸发仪(瑞士步琪公司);KQ-500B 型超声波清洗器(功率:250 W，频率:50 kHz，昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

桦木酸对照品为自制，归一化法测得其纯度大于98%。

1.3 药材与试剂

不同批次泽兰药材购于南京各大药房，经江苏省中医药研究院钱士辉研究员鉴定为泽兰。甲醇(江苏汉邦科技有限公司)为色谱纯;磷酸为分析纯;水为重蒸馏水(Milli-Q 纯水器制得)

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:AlltimaTM -C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm);流动相为甲醇-0.2%磷酸水溶液(85∶15);流速1. 0 mL·min-1);检测波长为202 nm;柱温:35 ℃;进样量20 μL。

2.2 对照品溶液的制备

取已干燥至恒重的桦木酸对照品9.92 mg，放置于5 mL 容量瓶中，以甲醇溶解稀释并定容至刻度，配置成桦木酸质量浓度为1.984 mg/mL 的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取泽兰粉末(过4 号筛，孔径4.75 mm)约3 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加95%乙醇100 mL，加热回流4 h，过滤，旋干，用甲醇转移并定容至10 mL 容量瓶中。以0.45 μm 微孔滤膜过滤，即制得供试品溶液。

2.4 对照品和样品的色谱行为

按上述色谱条件，进行样品及对照品HPLC 检测，样品与对照品在相同的保留时间处有相应的色谱峰，且与杂质峰得到较好的分离，见图1。

2.5 线性关系的考察

依次精密吸取混合对照品溶液2、5、10、20、30、50 μL 注入高效液相色谱仪，测定峰面积。以峰面积s 的常用对数(Y)对进样量(μg)的常用对数(X)进行线性回归。结果表明，对照品在3. 968 ～99.200 μg 线性关系良好，回归方程为:y =1. 5 ×10-6x-2.458 2，r=0.997 3。

图1 对照品及样品HPLC 图

2.6 精密度试验

精密吸取对照品溶液10 μL，在上述色谱条件下连续进样6 次，以峰面积计算其精密度，RSD 为0.425%。

2.7 重复性试验

精密称取同一批次(安徽20120701)泽兰药材6份，每份3.0 g。按“2.3”项方法进行操作，制得6份供试品溶液。分别取20 μL 注入液相色谱仪进行测定，结果得桦木酸含量平均值(n =6)为11.740 mg，RSD 值为1.932%。表明本方法重复性良好。

2.8 稳定性试验

取同一批次(安徽20120701)供试品溶液分别于0、2、4、8、12 h 进样20 μL，测定峰面积。结果得桦木酸峰面积的RSD(n =5)为1.382%。表明供试品溶液在12 h 内基本稳定，本方法有良好的稳定性。

2.9 加样回收率试验

取已知含量(桦木酸的含量为0.324%)的泽兰粉末(安徽20120701)6 份，每份0.6 g。分别向其中加入桦木酸的对照品2 mg。按“2.3”项方法进行操作，最后浓缩提取液并加甲醇定容至10 mL 容量瓶中，制得6 份加标溶液，分别进样20 μL，结果得到桦木酸的平均回收率(n =6)为100.87%，RSD 为1.74%。结果见表1。

2.10 样品测定

取不同批次的样品各3 份，精密吸取按“2.3”项下方法制备的供试品溶液，进样测定，按外标法计算样品中桦木酸的平均含量，结果见表2。

表1 样品回收率测定结果

表2 样品含量测定结果

3 讨 论

3.1 流动相的选择。分别考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.2%磷酸水、乙腈-0.2%磷酸水4 个溶剂系统。结果表明采用甲醇-0.2%磷酸水等度洗脱，桦木酸的在样品中的峰形和分离度均达到要求。为保证色谱峰定性的准确性，除上述流动相外，还采用甲醇-0.2%磷酸水溶液(70∶30)、乙腈-0.2%磷酸水溶液(65∶35)作为流动相，进行了样品与对照品的定性比较，结果在不同洗脱条件下，样品均有相同的色谱峰与对照品对应。

3.2 检测波长的选择。桦木酸的紫外扫描结果表明，在202 nm 处有最大吸收，且无其他成分干扰，所以选定检测波长为202 nm。

3.3 样品提取方法的选择。根据对照品的溶解性，选择以乙醇为溶剂。考察了甲醇质量分数、提取方式、时间、温度和提取次数、对样品中所测成分的影响，以桦木酸的峰面积为评价指标，结果表明:95%乙醇热回流提取4 h 为最佳提取条件。

3.4 不同批次药材的含量分析。对采自安徽和江苏的10 批药材进行含量测定后发现，所有批次的药材中均含有桦木酸。但是由于采收时间不同，导致不同批次中桦木酸含量有差异。同时贮存方法、种植条件等也会对桦木酸的含量产生影响。

本研究首次建立了RP -HPLC 法测定泽兰中桦木酸含量的方法。该方法准确、灵敏，可为建立泽兰的质量标准提供参考。

［1］ 国家药典委员会.中国药典:一部［S］.北京:化学工业出版社，2010:212.

［2］ 孙连娜，陈万生，陶朝阳.泽兰化学成分的研究Ⅱ［J］. 解放军药学学报，2004，20(3):172.

［3］ Toshihiro M，Mai W，Yu T，et al. Hyaluronidase inhibitors from takuran，Lycopus lucidus［J］. Chem pharm Bull，2010，58(3):394.

［4］ 聂波.泽兰及地笋活性成分的研究［D］.北京中医药大学博士论文，2006.

［5］ 王涛，李超，濮社班，等.泽兰的化学成分研究［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18(5):83 -85.