山绿茶有效部位抗大鼠非酒精性脂肪肝药效研究

崔伟曦，杨 杰，陈筱清，毛 茜，闻晓东，王 强*

(1.中国药科大学 中药学院中药分析教研室，江苏 南京210009;2.首都医科大学 中药学院，北京100069)

山绿茶为冬青科冬青属植物海南冬青(Ilex hainanensis Merr.)的干燥叶，主产于广西、海南等地，全年可采，资源丰富，具有悠久的民间药用历史，多泡茶饮，具有清热解毒，消肿止痛，活血通脉的功效，主要用于降血压，降血脂，降胆固醇，冠心病，脑血管意外所致的偏瘫等疾病［1］。本实验室前期研究表明，山绿茶对高脂饲料诱导的大鼠非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD)疗效显著，但其有效部位和活性成分尚不明确。化学研究表明，山绿茶中富含酚酸和黄酮类成分［2-3］，故本文对山绿茶中总酚酸和总黄酮两个有效部位抗大鼠非酒精性脂肪肝的药效作用进行了研究，以期对山绿茶资源的开发与有效利用及药效学研究提供依据。

1 材 料

1.1 植物来源

山绿茶采自广西，由中国药科大学王强教授鉴定为冬青科冬青属植物海南冬青(Ilex hainanensis Merr.)的叶，标本(No.20080201)存放于中国药科大学中药分析教研室。

1.2 主要试剂与仪器

甘油三酯(TG)试剂盒，总胆固醇(TC)试剂盒，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)试剂盒，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)试剂盒，血浆谷丙转氨酶(ALT)测定试剂盒，血浆谷草转氨酶(AST)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所;乙腈和甲酸购自Merck 公司(色谱纯，Merck，Darmstadt，Germany);其它试剂均为分析纯。

紫外- 可见分光光度计(UV - 2501PC，Shimadzu);高效液相色谱仪(Agilent 1100 Series)、DAD检测器、Agilent ChemStation 色谱工作站;色谱柱(Kromasil，4.6 ×150 mm);酶标仪(Epoch，BioTek，USA);匀浆机(IKA，T10 basic Ultra - TURRAX，Germany)。

1.3 动物及饲料

清洁级雄性SD 大鼠(120 ～150 g)，由江苏大学实验动物中心提供(许可证号SCXK(苏)2000 -0002)。

高脂饲料配方 基础饲料858 g/kg，猪油100 g/kg，胆固醇10 g/kg，胆酸钠2 g/kg，蔗糖30 g/kg;普通饲料及高脂饲料均由江苏省南京市青龙山动物繁殖厂提供。

2 方 法

2.1 山绿茶总酚酸和总黄酮的制备

取山绿茶药材5 kg，以80 %乙醇溶液浸泡过夜，加热回流提取2 次，每次2 h。提取液减压回收溶剂，浓缩得稠浸膏，以4 000 r·min-1离心10 min，分离得到上清液和沉淀部分。上清液经HPD -400大孔树脂吸附分离，先以水洗脱3 倍柱体积，弃去，再分别以10%、30%和50%乙醇洗脱，合并10%和30%乙醇洗脱液，减压回收溶剂，浓缩得浸膏，自然晾干，粉碎，过60 目筛，得到山绿茶总酚酸有效部位，得率1.62%;取50%乙醇洗脱液，减压回收溶剂，浓缩得浸膏，自然晾干，粉碎，过60 目筛，得到山绿茶总黄酮有效部位，得率1.52%。实验时，一定量总酚酸和总黄酮粉末用0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)制成混悬溶液用于给药。

2.2 山绿茶总酚酸和总黄酮的测定

2.2.1 山绿茶总酚酸的测定

精确称取总酚酸粉末约4 mg，置棕色量瓶中，精密加入50%乙醇20 mL，称重，超声提取30 min，用50%乙醇补足原重，过滤，续滤液即为供试品溶液。精密量取供试品溶液1.0 mL，置于25 mL 棕色量瓶中，加50%乙醇至5 mL，再分别精密加入0.3%十二烷基硫酸钠硫酸钠溶液2 mL 和0.5%铁氰化钾-1%三氯化铁(1∶1)混合溶液1 mL，摇匀，暗处放置5 min，加0.1 moL/L 盐酸溶液至25 mL，摇匀，暗处放置20 min，在729 nm 波长处测定吸收值。以绿原酸为对照品，制备标准曲线，得回归方程，计算总酚酸含量。

2.2.2 山绿茶总黄酮的测定

精密称总黄酮粉末约10 mg，置锥形瓶中，加入20 mL 甲醇，称重，超声提取30 min，用甲醇补足原重，过滤，取续滤液即为供试品溶液。精密量取供试品溶液1.0 mL，置于10 mL 量瓶中，加甲醇至3 mL，加5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min，加10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min，加4%氢氧化钠试液4 mL，在再加甲醇至刻度，摇匀，放置15 min，在500.5 nm 波长处测定吸收值。以芦丁为对照品，制备标准曲线，得回归方程，计算总黄酮含量。

2.3 总酚酸和总黄酮中主要成分含量测定

2.3.1 总酚酸中绿原酸的含量测定

取总酚酸粉末约2 mg，精密称定，置1 mL 棕色量瓶中，精密加入甲醇0.8 mL，超声处理30 min，放冷，甲醇定容至1 mL，用0.45 μm 的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。在下述色谱条件下，以绿原酸为对照品，标准曲线法进行检测定量。色谱条件:色谱柱:Kromasil C18 柱(4.6 mm×150 mm);柱温:25 ℃;流速:1 mL/min。流动相:A:0.1%甲酸-水，B:0.1%乙腈;进样量:10 μL。梯度洗脱程序见表1;检测波长:326 nm。

表1 总酚酸中绿原酸测定梯度洗脱程序

2.3.2 总黄酮中芦丁和华中冬青黄酮-7 -O -β-D-吡喃葡萄糖苷的含量测定

精密称取总黄酮粉末约2 mg，置于1 mL 量瓶中，精密加入0.8 mL 甲醇，超声30 min，放冷，甲醇定容至1 mL，用0.45 μm 的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。在下述色谱条件下，以芦丁和华中冬青黄酮-7 -O -β -D -吡喃葡萄糖苷制备混合对照品，标准曲线法进行检测定量。色谱条件:色谱柱:Kromasil C18柱(4.6 mm ×150 mm);柱温:25 ℃;流速:1 mL/min。流动相:A:0.1%甲酸-水，B:0.1%乙腈;进样量:10 μL。梯度洗脱程序见表2;检测波长:256 nm、285 nm。

表2 总黄酮中芦丁和华中冬青黄酮测定梯度洗脱程序

2.4 大鼠非酒精性脂肪肝模型的建立

34 只雄性SD 大鼠适应性饲养1 周之后，随机分为正常组(n=11)和模型组(n=23)，正常组大鼠给以普通饲料，模型组大鼠给以高脂饲料。饲养室内温度控制在20 ±2 ℃，相对湿度60% ～70%，明暗各12 h，自由饮水、进食。3 周后，隔夜禁食12 h，眼眶静脉取血，分离血浆，测定各大鼠血浆甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL -c)、谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)。另外，随机抽取各组5 只大鼠，脱颈椎处死，分离肝脏并称重，计算肝指数(肝湿重/大鼠体重×100%)，并取肝脏相同部位用4%中性多聚甲醛固定，进行肝脏病理学检查。测定结果(表3)显示，与正常组相比，模型组大鼠体重和肝指数均显著升高(P ＜0.05，P ＜0.01)，血浆TG、TC、LDL-c、ALT 和AST 也较正常组明显升高(P ＜0.01)，HDL-c 较正常组降低(P ＜0.01);H＆E 染色结果显示(图1A 和B)，正常组大鼠肝脏肝小叶结构清晰，肝细胞排列呈索状，肝窦无扩张充血，未见明显的脂肪变性;模型组大鼠肝脏肝小叶结构尚可见，但部分肝细胞体积变大变圆、胞浆内有许多小的脂肪空泡或融合成较大的脂滴，肝窦受压变窄，出现明显的脂肪变性，由此表明，NAFLD 模型建立成功。

2.5 给药方法

造模成功后，模型组大鼠随机分为模型对照组(n=6)、酚酸给药组(n=6)和黄酮给药组(n =6)。以上3 组大鼠给以高脂饲料，正常组大鼠(n =6)给以普通饲料，所有大鼠均自由进食和饮水。此外，酚酸给药组灌胃给以105 mg/(kg·d)总黄酮-0.5%CMC-Na 混悬液，黄酮给药组给以100 mg/(kg·d)总酚酸-0.5%CMC -Na 混悬液，即相当于生药量6.5 g/(kg·d);正常组和模型对照组给以10 mL/(kg·d)0.5%CMC-Na。给药周期为2 周。

2.6 肝指数和血液指标的检测

给药2 周后，大鼠隔夜禁食12 h，称量体重，眼眶静脉取血，分离血浆，并分离出肝脏，预冷生理盐水洗净，吸水纸吸干，称取肝脏湿重，计算肝指数。

血浆TG、TC、LDL -c、HDL -c、ALT 和AST 的含量按照相应试剂盒的说明书进行测定。

2.7 肝脏中TG 和TC 的测定

剪取相同部位肝组织，用无水乙醇制成10%肝匀浆(肝组织重量∶无水乙醇体积=1∶9)。肝组织中TG 和TC 含量按照相应试剂盒的说明书进行测定。

2.8 肝脏病理学检查

取相同部位肝组织，4%中性多聚甲醛溶液固定，脱水，石蜡包埋，制片(4μm 厚)，苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin，HE)染色，由病理专业人员在光学显微镜下阅片，观察组织的病理学改变，并按照肝细胞脂肪变的程度进行评分(计分:0，无;计分:1，＜1/4;计分:2，1/4 ～1/2;计分:3，1/2 ～3/4;计分:4，＞3/4)［4-5］。

2.9 统计学处理

采用SPSS11.5 统计软件进行统计学分析。计量资料以± SEM 表示。P ＜0. 05 为有统计学差异，P ＜0.01 为有显著统计学差异。

3 结 果

3.1 山绿茶总酚酸和总酚酸及其主要成分的含量

紫外-可见分光光度法结果显示，总酚酸的含量为78.33% ±0.29%，总黄酮的含量为75.32% ±0.35%。高效液相法结果显示，山绿茶总酚酸中绿原酸的含量为3.70% ±0.12%;总黄酮中芦丁的含量为1.27% ±0.05%，华中冬青黄酮-7 -O -β -D-吡喃葡萄糖苷的含量为1.78% ±0.03%。

3.2 各组大鼠体重、肝指数及血液指标的变化

各组大鼠体重、肝指数及各血液指标的结果见表3。喂食5 周后，模型组大鼠体重和肝指数均较正常组显著升高(P ＜0.05，P ＜0.01)，血浆TG、TC、LDL-c、ALT 和AST 也较正常组明显升高(P ＜0.05 或P ＜0. 01)，HDL - c 较正常组降低(P ＜0.01)。与模型组相比，酚酸给药组和黄酮给药组大鼠体重和肝重均有降低的趋势，酚酸给药组大鼠体重和肝重分别较模型组降低3.72%和9.57%，黄酮给药组降低8.09%和12.57%，但未呈现显著性差异(P ＞0.05);酚酸给药组和黄酮给药组大鼠肝指数分别较模型组降低6.44%和5.71%，且存在显著性差异(P ＜0.05);血脂各项指标的检测结果显示，酚酸给药组和黄酮给药组大鼠血浆TG、TC 和LDL-c 分别较模型组降低41.58%和35.70%(P ＜0.05)、37.44%和33.60%(P ＜0.05)、43.09%(P＜0.05)和64.43%(P ＜0.01)，HDL -c 分别较模型组升高32.65%和22.45%(P ＜0.05);转氨酶检测结果显示，酚酸给药组和黄酮给药组大鼠血浆ALT 分别较模型组降低33. 20% (P ＜0. 01)和21.50%(P ＜0. 05)、AST 分 别 较 模 型 组 降 低27.75%(P ＜0.01)和14.30%(P ＜0.05)。由以上结果可以看出，总黄酮在降低NAFLD 大鼠体重和肝重方面略优于总酚酸;而总酚酸在改善血脂和转氨酶方面略优于总黄酮，但差异并不显著，提示山绿茶抗NAFLD 是通过多种成分共同作用实现的。

表3 各组大鼠体重、肝指数及各血液指标的比较

3.3 各组大鼠肝组织中TG 和TC 的含量变化

各组大鼠肝脂质TG、TC 含量见表4。与正常组相比，模型组大鼠10%肝组织匀浆中TG 和TC 含量均显著升高(P ＜0.01)。酚酸给药组大鼠肝匀浆中TG 含量较模型组降低5.72%，但两组间不存在显著性差异，TC 含量较模型组降低18.55%(P ＜0.01);黄酮给药组大鼠肝匀浆中TG 和TC 含量分别较模型组降低20.71%和26.62%(P ＜0.01)，在降低NAFLD 大鼠肝脂质含量方面略优于酚酸组。

表4 各组大鼠肝脏中甘油三酯和胆固醇的含量

3.4 各组大鼠肝脏组织形态学变化

光镜下观察各组大鼠肝组织HE 染色切片，结果如图1 所示，3 周时正常组大鼠肝组织肝小叶结构清晰，肝细胞排列呈索状，肝窦无扩张充血，未见明显的脂肪变性(图1A);模型组大鼠肝组织肝小叶结构尚可见，但部分肝细胞体积变大变圆、胞浆内有许多小的脂肪空泡或融合成较大的脂滴，肝窦受压变窄，出现明显的脂肪变性(图1B)。5 周时正常组大鼠肝组织形态基本与3 周时相同，未见异常病理变化(图1C);模型组大鼠肝组织脂变程度较3 周时明显加重，呈弥漫性脂肪变性(图1D);酚酸给药组大鼠(图1E)和黄酮给药组大鼠(图1F)肝组织脂肪变性程度均明显减轻，脂变积分如图1G 所示，与模型组相比，酚酸给药组和黄酮给药组大鼠肝组织脂变积分均显著降低(分别为P ＜0. 05 和P ＜0.01)，黄酮的改善效果略优于酚酸，但2 组的脂变积分之间不存在显著性差异。

图1 肝组织病理切片(HE 染色，×200)

4 结 论

山绿茶总黄酮在降低非酒精性脂肪肝大鼠体重、肝重，肝脂质TG 和TC 含量以及改善肝脏组织形态和脂肪变性方面略优于总酚酸;而总酚酸在改善血脂和转氨酶方面略优于总黄酮，但两有效部位抗非酒精性脂肪肝药效作用差异并不显著，提示山绿茶抗非酒精性脂肪肝是通过多种成分共同作用实现的。

山绿茶为常绿植物，其叶四季均可采，资源丰富。目前山绿茶主要作为生产山绿茶降压制剂的原料药材，疗效显著，此外，药理研究表明，山绿茶对于高血脂症也具有较好的防治作用［6］，本实验研究结果表明，山绿茶总酚酸和总黄酮对非酒精性脂肪肝也有较好的治疗作用。鉴于其较高的药用价值及丰富的资源，山绿茶值得进一步开发利用。

［1］ 广西壮族自治区卫生厅. 广西中药材标准:1990 年版［S］. 南宁:广西科学技术出版社，1992.

［2］ Chen X Q，Zan K，Yang J，Lai M X，et al. A novel flavanone from Ilex hainanensis Merr. ［J］. Natural Product Research，2009，23(5):442 -447.

［3］ 陈勇，李耀华，谢臻，等.山绿茶不同炮制品中绿原酸的含量比较［J］.中药材，2005，28(2):107 -109.

［4］ Dixon J B，Bhathal P S，Hughes N R，et al. Nonalcoholic fatty liver disease:improvement in liver histological analysis with weight loss［J］. Hepatology，2004，39:1647 -1654.

［5］ Kirsch R，Clarkson V，Shephard EG，et al. Rodent nutritional model of non - alcoholic steatohepatitis:species，strain and sex difference studies ［J］. Journal of Gastroenterology Hepatology，2003，18:1272 -1282.

［6］ 方如塘，魏堂昇.山绿茶醇提物对大鼠实验性高脂血症防治作用的研究［J］.西北药学杂志，2011，26(2):123 -125.