狗头枣叶片原生质体分离研究

齐向英，陈宗礼，薛 皓，刘航娟，行文珍，谢 路

［陕西省红枣重点实验室(延安大学)，延安大学 生命科学学院，陕西 延安716000］

枣(Ziziphus jujube Mill.)属于鼠李科(Rham naceae)枣属(Ziziphus Mill.)植物。红枣素有“天然维生素丸”之美称，其所含的维生素不仅种类多，而且含量高。鲜枣维生素C 的含量是苹果的75 倍，桃子的80 ～100 倍［1］。狗头枣果实卵圆形或锥形，似狗头状，有“枣中状元”的美名。这不只是因为它的种植效益好，关键是狗头枣的维生素、粗纤维、磷、铁等多种微量素的含量居各类红枣之首［2］。陕北地区盛产的狗头枣，其果实大、品质好、为优良鲜食制干兼用枣品种，平均单果重18.79 g，果实较整齐，外形美观，果皮中厚，褐红色，果肉细脆、叶液中多，味酸甜，适宜鲜食和制干。近年来狗头枣的研究报道逐渐增多，这些报道集中狗头枣的形态解剖学研究、组培快繁、多倍体育种等方面。但有关狗头枣原生质体分离至今未见报道。本文研究的目的是通过正交设计探索狗头枣叶片原生质体分离的最佳酶液浓度和甘露醇浓度，为狗头枣叶片原生质分离提供实验依据。

1 实验材料与方法

1.1 材料

实验用材料为按陈宗礼［3］等方法培养25 d 狗头枣组培苗。

1.2 方法

实验设计:按三因素四水平设计实验，分别设计纤维素酶(sigma)0.1 g/L、0.25 g/L、0.5 g/L、1.0 g/L 四个浓度水平;果胶酶(sigma)0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L 四个浓度水平;甘露醇0.5 mol/L、0.6 mol/L、0.7 mol/L、0.8 mol/L 四个浓度水平;共16 个组合［4］。

原生质体分离:在超净工作台中，取培养好的狗头枣试管苗叶片，剪取顶端完全展开的5 片叶子。称重后，将叶片剪成1 ～2 mm 的细条状放入经过滤灭菌后的混合酶液中，使材料和酶液的体积比为1∶10。在(25 ±2)℃、50 r/min 的摇床上、黑暗的条件下震荡酶解。每隔2 h 取酶解液观察并统计原生质体数量，直至原生质数量不在增加，确定最佳酶解时间。

原生质数量测定:使用血球计数板对原生质体产量进行统计

原生质体数(个/mL)= 5 个大格内总原生质体数×5 ×1 000 ×原生质体稀释倍数。每个样处理平均计数测定3 次以上，最后取其平均值。

原生质产量=原生质体数(个/mL)×稀释后体积(mL)÷悬浮细胞总质量(g)

原生质体活力测定:FDA 荧光染色法。

原生质体活力 =(被染上色的原生质体数÷观察到的原生质体总数)×100%

活原生质体产量=原生质体产量×原生质体活力

2 结果与分析

在狗头枣叶片酶解过程中，从酶解开始的第2 h开始，每隔2 h 吸取酶解混合液并进行原生质体纯化。将纯化后的原生质体，在血球计数板上进行计数，计算其原生质体产量，直到原生质体的数目比前一次记录的个数不再增加时，停止酶解。从实验记录的结果中，我们发现在狗头枣叶片酶解过程进行到8 h，获得的原生质体数目比较多，活原生质体数量也比较大，分离效果比较理想，统计结果见表1。

2.1 不同组合对狗头枣叶片原生质分离的影响

在不同酶液浓度和甘露醇浓度组合中，F15 的组合纤维素酶1.0 g/L、果胶酶0.4 g/L、甘露醇0.6 mol/L 分离的效果最好，原生质体的产量达到2.12×106个/g，活原生质体数达到1.72 ×106个/g，成活率达到80.88%。其次为F16 纤维素酶1.0 g/L、果胶酶0.5 g/L、甘露醇0.5 mol/L，原生质体的产量为1.69 ×106个/g，活原生质体数达到1.03 ×106个/g，成活率达到61.121%。原生质体产量最低的组合为F14 纤维素酶1.0 g/L、果胶酶0.3 g/L、甘露醇0.7 mol/L，原生质体的产量为0.7 ×106个/g，活原生质体数达到0.53 ×106个/g。

2.2 酶液浓度对分离原生质体的影响

由统计结果表可知纤维素酶含量对狗头枣叶片原生质分离的效果为k4＞k3＞k2＞k1。在纤维素酶含量分别为0.1 g/L、0.25 g/L、0. 5 g/L、1. 0 g/L时，原生质体产量的平均数分别为0.665 ×106个/g、1.187 5 × 106个/g、1. 22 × 106个/g、1.507 5 × 106个/g;活原生质产量的平均数分别为0.175 ×106个/g、0.22 ×106个/g、0.235 ×106个/g、0.75 ×106个/g。说明在狗头枣叶片原生质体分离过程中需要纤维素酶的含量较多。当纤维素酶浓度为1.0 g/L 时，狗头枣叶片原生质体的产量和活性都比较大。极差分析显示纤维素酶对狗头枣叶片原生质体分离的效果差值为0.765，对活原生质获得的效果差值为0.43。

果胶酶含量对狗头枣叶片原生质体分离的效果为k4＞k3＞k1＞k2。在果胶酶浓度分别为0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L 时，原生体1.032 5 ×106个/g、0.775 ×106个/g、1.232 5 ×106个/g、1. 54 ×106个/g;活原生质产量的平均数分别为0.172 5 ×106个/g、0.15 ×106个/g、0.58 ×106个/g、0.415 ×106个/g。当果胶酶浓度为0.4 g/L，获得的原生质体数量和活原生质体的产量较大。极差分析显示果胶酶对狗头枣叶片原生质体分离的效果差值为0.842 5，对活原生质获得的效果差值为0.575。

2.3 渗透压浓度对分离原生质体的影响

甘露醇浓度对狗头枣叶片原生质体分离的效果为k2＞k1＞k4＞k3。在甘露醇浓度分别为0.5 mol/L、0.6 mol/L、0.7 mol/L、0.8 mol/L 时，狗头枣叶片原生质产量的平均数分别为1.16 ×106个/g、1.325×106个/g、0.99 ×106个/g、1.105 ×106个/g，或原生质体产量的平均数分别为0.455 ×106个/g、0.54 ×106个/g、0.235 ×106个/g、0.15 ×106个/g。当甘露醇浓度为0.6 mol/L 时，对狗头枣叶片原生质体产量和活原生质体产量的影响较大。极差分析显示甘露醇浓度对狗头枣叶片原生质体分离的效果差值为0.335，对活原生质获得的效果差值为0.39。

由以上结果可以看出，在用纤维素酶、果胶酶和甘露醇的混合液来分离狗头枣叶片原生质体的过程中分离的主次因素分别为A 因素(纤维素酶)、B 因素(果胶酶)、C 因素(甘露醇)。由此得到原生质获得量的组合为A4B4C2;获得活原生质体获得率的组合为A4B3C2。材料和酶液的比例为1∶10。酶解时间为8 h。本研究中的F15 原生质体的产量达到2.12 ×106个/g，活原生质体数达到1.72 ×106个/g，成活率达到80.88%，恰好是活原生质体获得率的组合A4B3C2。所以我们认为适合狗头枣叶片原生体分离的最佳组合为A4B3C2。

表1 不同酶液组合对原生质体分离的影响

3 讨 论

原生质体是植物除去细胞壁后，具有活性的最小单位［5］，植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶。植物原生质分离的过程主要就是除去这两种物质。分离中常用到的酶为纤维素酶和果胶酶，酶液通常需要保持较高的渗透压［6］，以便使原生质体在分离前细胞处于质壁分离状态，分离后不致膨胀破裂，常用的渗透压稳定剂为甘露醇等。本文的研究也采用了纤维素酶、果胶酶和甘露醇来完成。

我国从1974 年以来许多单位也相继开展这方面的研究工作［7］。何业华［8］等用枣树胚性悬浮培养细胞、细粒状胚性愈伤组织、未细切愈伤组织和已细切愈伤组织4 种材料做了原生质体分离研究，发现用浓度为10 g/L 纤维素酶+1 g/L 离析酶+CPW盐+0.7 mol/L 甘露醇组成的混合酶液对起始材料进行16 h 的酶解，可获得较高的原生质体产量，且原生质体活力较高。刘晓光等［7］用冬枣花药愈伤组织悬浮系做了原生质体分离研究发现用0.6 mol/L 甘露醇+0.1%MES+20 ～25 g/L 纤维素酶，酶解16 h得到的原生质体产量和活力较高。赵维峰［9］等研究了毛叶枣和冬枣愈伤组织的原生质体分离条件发现毛叶枣酶解所需酶液浓度为纤维素酶10 g/L+离析酶4 g/L+甘露醇0.7 mol/L;冬枣酶解所需酶液浓度为纤维素酶15 g/L+离析酶4 g/L+甘露醇0.7 mol/L，酶解时间均为14 ～16 h。邢东方［10］以继代20 d 左右的灰枣试管苗顶梢3 片完全展开的嫩叶为分离材料在2.0% Cellulase R -10 +0.1%MacerozymeR-10 +0.1% Pectolase Y -23 +0.4 %Driselase 酶液中获得了原生质体，产量为1.1 ×107个/g·FW，活性为85.7%，并发现4 种酶中，对原生质体分离影响大小顺序为Driselase ＞CellulaseR -10 ＞MacerozymeR -10 ＞Pectolase Y -23，Driselase对原生质体的分离起首要作用。牛瑜菲［11］研究了酸枣花粉四分体时期原生质体分的酶液组合发现用蜗牛酶1.0% +纤维素酶0.5% +甘露醇0.3 mol/L+0.1% MES，酶解4 h 效果最佳，同时在酸枣叶片愈伤组织悬浮细胞系原生质体分离时的酶液浓度为纤维素酶10 g/L+离析酶5 g/L+甘露醇0.7 mol/L+0.1% MES，酶解时间16 h。赵维峰［12］用毛叶枣做研究，发现组培苗叶片分离出具有活性的原生质体能力优于愈伤组织的悬浮系，其中毛叶枣所需酶液浓度为纤维素酶10 g/L +离析酶4 g/L +甘露醇0.7 mol/L;冬枣所需酶液浓度为纤维素酶15 g/L+离析酶4 g/L+甘露醇0.7 mol/L。

本文的研究结果和上述研究存在一定差异的原因可能是所用的材料具有个体差异。本实验只对狗头枣组培苗叶片原生质体分离过程中纤维素酶、果胶酶、甘露醇浓度组合进行了探讨。至于其它的组织或因素是否会对其原生质分离效果存在影响还需进一步的研究。

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